Teste de hidrólise de amido em bactérias para descobrir sua capacidade de hidrolisar o amido

Teste de hidrólise de amido em bactérias para descobrir sua capacidade de hidrolisar o amido!

Princípio:

Algumas bactérias têm a capacidade de hidrolisar o amido, pois podem produzir a enzima sacarolítica.

Enquanto o amido forma uma cor azul escura com o iodo, os seus produtos finais hidrolisados ​​não adquirem essa cor azul escura com o iodo.

No teste de hidrólise de amido, as bactérias de teste são cultivadas em placas de ágar contendo amido. Depois que as colônias das bactérias são visíveis, as placas são inundadas com solução de iodo. Se a bactéria tem a capacidade de hidrolisar o amido, suas colônias hidrolisam o amido no meio nas áreas ao seu redor, enquanto o resto das áreas das placas contêm amido não hidrolisado.

Como resultado, quando inundadas com solução de iodo, zonas claras transparentes são formadas ao redor das colônias, já que os produtos hidrolisados ​​formados ao redor deles não formam cor azul escura com iodo. Por outro lado, o resto das áreas das placas torna-se azul escuro, pois o iodo forma uma cor azul escura com o amido não hidrolisado nessas áreas.

Materiais requisitados:

Placas de Petri, frasco cônico, tampões de algodão, alça de inoculação, autoclave, bico de bunsen, câmara de fluxo laminar, jarra de descarte, incubadora, ágar amido, solução de Lugol, colônias isoladas ou culturas puras de bactérias.

Procedimento:

1. Duas placas de petri são limpas, cobertas com papel craft e amarradas com fio ou elástico (Figura 7.21). Este passo, assim como a esterilização das placas de Petri no passo 6, é omitido, se as placas de petri esterilizadas no forno forem utilizadas directamente.

2. Os ingredientes do meio de agar amido (contendo o amido como componente principal) ou o seu pó pronto necessário para 100 ml do meio são pesados ​​e dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml, agitando e agitando.

3. O seu pH é determinado utilizando um papel de pH ou um medidor de pH e ajustado para 7, 2 utilizando HCl 0, 1 N se for mais ou utilizando NaOH 0, 1 N se for inferior.

4. O balão é aquecido para dissolver o ágar no meio completamente.

5. O frasco é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

6. As duas placas de petri e o frasco cônico contendo meio de ágar amido são esterilizados a 121 ° C (15 psi de pressão) por 15 minutos em autoclave.

7. Após a esterilização, eles são removidos da autoclave e deixados esfriar por algum tempo, sem permitir que o meio solidifique. O resfriamento do meio evita a condensação e o acúmulo de gotículas de água dentro das placas. Se o meio já tiver sido preparado e solidificado durante o armazenamento, ele deve ser liquefeito aquecendo cuidadosamente até que derreta completamente.

8. Para preparar placas de agar amido, antes que o meio de agar amido esterilizado esfrie e solidifique, em estado quente fundido, é vertido assepticamente, preferivelmente dentro de uma câmara de fluxo laminar, nas duas placas de petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada), de modo que o meio derretido cobre completamente o fundo das placas de petri.

Em seguida, as placas são cobertas por suas pálpebras e deixadas esfriar, de modo a solidificar o meio nelas. O vapor de água que pode condensar na superfície interna das placas e tampas é evaporado, mantendo as placas e tampas invertidas em uma incubadora a 37 ° C por cerca de 1 hora.

9. Cada placa é marcada no lado inferior em quatro trimestres.

10. A “inoculação pontual” das bactérias de teste é feita assepticamente, preferencialmente dentro de uma câmara de fluxo laminar, no centro de cada quarto, fazendo um ponto (ou pequeno esfregaço) das bactérias com a ajuda de um laço esterilizado por chama. O laço é esterilizado após cada inoculação.

11. As placas inoculadas são incubadas em posição invertida, de cima para baixo, a 37 ° C por 24 a 48 horas em uma incubadora até que as colônias das bactérias sejam visíveis.

12. As placas são inundadas com solução de iodo de Lugol.

Observações:

1. Zonas claras transparentes formadas ao redor de colônias de bactérias: Hidrólise de amido positiva.

2. Zonas transparentes e transparentes não formadas em redor das colónias de bactérias: Hidrólise do amido negativa.