Teste Ortho-Nitrofenyl Galactoside em Bactérias para Encontrar a Capacidade de Hidrolisar Ortho-Nitrofenyl-PD-Galactoside

Leia este artigo para saber mais sobre o desempenho do teste Ortho-nitrofenil galactosídeo em bactérias para encontrar sua capacidade de hidrolisar orto-nitrofenil-PD-galactosídeo!

Princípio:

Algumas bactérias têm a capacidade de fermentar a lactose. Eles são chamados de 'bactérias fermentadoras de lactose' ou 'fomentadores de lactose'.

Os outros, que não podem fermentar a lactose, são chamados de bactérias não fermentadoras da lactose ou lactose-não-fomentadores.

As bactérias fermentadoras de lactose podem produzir duas enzimas, nomeadamente 'permease' e 'β-galactosidase', que estão envolvidas na fermentação da lactose. A permease ajuda na entrada de lactose nas células bacterianas, enquanto a β-galactosidase hidrolisa lactose a glicose e galactose, β-galactosidase é uma enzima intracelular indutível, cuja produção é induzida pela presença de lactose no ambiente das células bacterianas.

Embora as bactérias que fermentam a lactose possam produzir tanto a permease como a β-galactosidase, as bactérias não fermentadoras da lactose não podem produzir a permease, mas podem ou não produzir a β-galactosidase. O teste ONPG é realizado para descobrir a capacidade de bactérias não fermentadoras de lactose para produzir β-galactosidase.

Para isto, a membrana celular das células de bactérias não fermentadoras de lactose é dissolvida pela adição de tolueno, de modo a libertar todas as enzimas intracelulares incluindo a P-galactosidase, se presente. A enzima, β-galactosidase, hidrolisa o substrato orto-nitrofenil-β-D-galcitosídeo (ONPG) em orto-nitrofenol, que é de cor amarela.

No teste de galactosídeo orto-nitrofenil (teste ONPG), a bactéria de teste é cultivada em agar triplas agar de ferro (TSI agar), que contêm lactose. Se a bactéria é uma lactose não fermentada, como indicado pela cor vermelha e vermelha, uma suspensão espessa da bactéria é feita em solução salina, à qual é adicionado tolueno seguido pela solução de ONPG. Se a bactéria tem a capacidade de produzir a enzima P-galactosidase, a cor da suspensão de bactérias muda para amarelo.

Materiais requisitados:

Tubos de ensaio, frasco cônico, tampões de algodão, alça de inoculação, agulha de inoculação, autoclave, bico de bunsen, câmara de fluxo laminar, frasco descartável, incubadora, ágar TSI, solução de tolueno, o-nitrofenil-β-D-galactósido (ONPG), colônias isoladas ou culturas puras de bactérias.

Procedimento:

1. Os ingredientes do meio TSI agar (contendo os três açúcares e o ferro como componentes principais) ou o pó pronto a perfazer, necessário para 100 ml de meio, são pesados e dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml. agitando e agitando (Figura 7.16).

2. Seu pH é determinado usando um papel de pH ou medidor de pH e ajustado para 7, 4 usando 0, 1 N HCI se é mais ou usando 0, 1N NaOH se for menor.

3. O balão é aquecido para dissolver completamente o ágar no meio.

4. Antes de solidificar, o meio em estado de fusão quente é distribuído em 5 tubos de teste (aproximadamente 20 ml cada).

5. Os tubos de ensaio são revestidos de algodão, cobertos com papel craft e amarrados com fio ou elástico.

6. Eles são esterilizados a 121 ° C (15 psi de pressão) por 15 minutos em autoclave.

7. Após a esterilização, eles são removidos da autoclave e mantidos em uma posição inclinada para resfriar e solidificar o meio, de modo a obter inclinações de ágar TSI.

8. A bactéria de teste é inoculada assepticamente, preferivelmente em uma câmara de fluxo laminar, nas inclinações, perfurando a parte superior e estriando na superfície das lâminas com a ajuda de uma agulha esterilizada por chama. A agulha é esterilizada após cada inoculação.

9. As lâminas inoculadas são incubadas a 37 ° C por 24 horas em uma incubadora.

10. Se a bactéria é um fermentador de lactose, ela não é selecionada para o teste ONPG. Se a bactéria é lactose-não-fermentadora, como indicado pela cor vermelha e inclinação vermelha, ela é selecionada para o teste ONPG.

11. A um tubo de ensaio contendo 0, 25 ml de solução salina, coloca-se uma cultura espessa das bactérias por meio de uma ansa esterilizada por chama, de modo a fazer uma suspensão espessa das bactérias.

12. Uma gota de tolueno é adicionada, misturada e incubada durante 5 minutos a 37 ° C.

13. A soluo de O-nitrofenil galactido (soluo de ONPG) adicionada e incubada a 37 durante 30 minutos. Então a mudança de cor é observada. Novamente a mudança de cor é observada após 24 horas.