Experiência para isolar o colifago de um vírus (com diagrama)

Experiência para isolar o colifago de um vírus!

Princípio:

O bacteriófago ou fago (vírus) que infecta a bactéria Escherichia coli é chamado de colifago (coli: E. coli, fago: bacteriófago).

Pode ser obtido a partir de uma variedade de fontes naturais, como solo, matéria fecal e esgoto bruto. Seu isolamento dessas fontes não é muito fácil, pois está presente em baixa concentração.

Portanto, primeiro seu número é aumentado por uma etapa de enriquecimento, na qual uma cultura rica da bactéria hospedeira (isto é, E. coli) é adicionada à amostra contendo colifago e incubada. O colifago infecta E. coli e aumenta em número profusamente. Esta cultura rica em colifago é centrifugada para sedimentar o material particulado.

O sedimento é descartado e o sobrenadante é filtrado através de filtro microbiano para reter bactérias e outras partículas, enquanto permite a passagem do colifago. O filtrado, rico em colifago, é usado para semear uma suspensão de E. coli, que é então permitida a crescer como um gramado confluente em uma placa de ágar.

O colifago cresce dentro das células de E. coli e as lisam. A lise das células bacterianas resulta na formação de zonas claras no gramado confluente das bactérias. Essas zonas claras são chamadas de placas. Cada zona clara é assumida como sendo formada por um único colifago.

Materiais requisitados:

Pipetas, frascos cônicos, placas de petri, tubos de ensaio, buchas de algodão, bico de bunsen, jarra de descarte, centrífuga, aparelho de filtração por membrana, câmara de fluxo laminar, autoclave, incubadora, caldo bacteriófago, ágar mole triptona, agar duro triptona, caldo nutriente bactérias Escherichia coli (por exemplo, E. coli B), amostra (por exemplo, esgoto bruto).

Procedimento:

1. Cinco pipetas (em uma caixa de pipetas de aço inoxidável) e cinco placas de petri são esterilizadas em um forno de ar quente a 180 ° C por 3 horas. Alternativamente, eles podem ser cobertos com papel ofício, amarrados com fio ou elástico e esterilizados em autoclave junto com o meio (Figura 8.5).

2. Os ingredientes do meio de cultura bacteriofágica ou do seu pó pronto a armazenar, necessários para 100 ml do meio, são pesados, dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml e o pH ajustado para 7, 6. O frasco é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

3. Os ingredientes do meio agar macio triptona ou do seu pó pronto a armazenar, necessários para 100 ml de meio, são pesados, dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml e o pH ajustado para 7, 5.

4. Este meio líquido é distribuído em 5 tubos de ensaio (2 ml cada), tapado com algodão, coberto com papel craft e amarrado com fio ou elástico.

5. Os ingredientes do meio agar duro com triptona ou o seu pó pronto a medir, necessário para 100 ml de meio, são pesados ​​e dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml por aquecimento após ajuste do pH a 7, 5ºC. O frasco é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

6. O frasco contendo caldo de bacteriófago, os 5 tubos de ágar mole de triptona, o balão contendo meio agar duro de triptona e um frasco cónico de 250 ml vazio, tapado com algodão, são esterilizados a 121 ° C (15 psi de pressão) durante 15 minutos numa autoclave.

7. O meio de agar duro de triptona esterilizado no frasco cico vertido para as 5 placas de petri esterilizadas, assepticamente e deixado a arrefecer, de modo a obter 5 placas de agar duro com triptona.

8. No balão cônico vazio de 250 ml esterilizado e tapado de algodão, 5 ml de caldo bacteriófago esterilizado, 5 ml de caldo de cultura E. coli B e 45 ml de esgoto bruto são transferidos assepticamente, preferencialmente em câmara de fluxo laminar (Figura 8.6) .

9. O frasco é incubado a 37 ° C por 24 horas, de modo a permitir que o colifago no esgoto prolifere dentro das células da bactéria hospedeira (células de E. coli B).

10. O conteúdo do frasco é vertido em tubos de centrífuga de 100 ml e centrifugado a 2500 rpm durante 20 minutos numa centrífuga para assentar as partículas. O sedimento é descartado.

11. O sobrenadante, rico em colifago, é filtrado através de um aparelho de filtração por membrana. O resíduo é descartado.

12. Os cinco tubos de ágar mole triptona esterilizados são retirados e aquecidos num banho de água a 100 ° C, de modo a derreter o agar. Os tubos são resfriados e mantidos a 45 ° C em banho-maria.

13. Utilizando uma pipeta estéril, 1, 2, 3, 4 e 5 gotas do filtrado isento de bactérias, rico em colifagos, é transferido assepticamente para os cinco tubos de agar mole triptona.

14. A cada tubo de ágar mole triptona, transfere-se assepticamente 0, 1 ml de uma cultura de caldo nutriente de Escherichia coli B.

15. O conteúdo dos cinco tubos de ágar-ágar triptona tendo o vírus, o colifago e as bactérias, E. coli B, são rapidamente misturados pela rotação dos tubos entre as palmas das mãos.

16. O conteúdo é vertido sobre as cinco placas de agar duro com triptona (rotuladas com 1 a 5 gotas), formando assim uma preparação de cultura em placa de dupla camada. As placas são rodadas suavemente e deixadas endurecer.

17. As placas inoculadas são incubadas em uma posição invertida a 37 ° C por 24 horas em uma incubadora.

Observações:

1. Todas as placas são observadas para unidades formadoras de placas (PFUs) que se desenvolvem como zonas claras no gramado das bactérias. A formação de placa é indicativa da presença de colifago na cultura.

2. Cada placa representa um rico crescimento de colifago isolado.

3. O número de placas é contado em todas as placas e tabulado da seguinte forma (Tabela 8.1).

Tabela 8.1: Observações do número de colifagos :