Teste de desoxirribonuclease em bactérias para descobrir suas habilidades para hidrolisar o DNA (com a figura)

Teste de desoxirribonuclease (Teste de DNase) em Bactérias para descobrir suas habilidades para hidrolisar o DNA (com a figura)!

Princípio:

Algumas bactérias têm a capacidade de hidrolisar o ácido desoxirribonucleico (DNA) em oligonucleotídeos, pois podem produzir a enzima hidrolítica extracelular "desoxirribonuclease" (DNase).

Enquanto o ADN é precipitado pela opacidade de produção de ácido clorídrico, os seus produtos finais hidrolisados, oligonucleótidos, não são precipitados por ácido clorídrico, pelo que não produzem essa opacidade; em vez disso, produzir transparência.

No teste da DNase, as bactérias de teste são cultivadas em placas de ágar contendo DNA. Depois que as colônias das bactérias são visíveis, as placas são inundadas com ácido clorídrico. Se as bactérias têm a capacidade de hidrolisar o DNA, suas colônias hidrolisam o DNA no meio nas áreas ao redor deles, enquanto o resto das áreas das placas contêm DNA não hidrolisado.

Como resultado, quando inundado com ácido clorídrico, zonas claras transparentes são formadas em torno das colônias, como os produtos hidrolisados, oligonucleotídeos, formados em torno deles não formam precipitados com o ácido clorídrico.

Por outro lado, as demais áreas das placas tornam-se opacas, pois o DNA não-hidrolisado nessas áreas forma precipitados com o ácido clorídrico. Se o azul de toluidina é usado em vez de ácido clorídrico, um halo rosa rosa é produzido apenas em torno das colônias.

Materiais requisitados:

Placas de Petri, frasco cônico, tampões de algodão, alça de inoculação, autoclave, bico de bunsen, câmara de fluxo laminar, jarra de lixo, incubadora, ágar DNase, ácido clorídrico IN (ou azul de toluidina 0, 1%), colônias isoladas ou culturas puras de bactérias.

Procedimento:

1. Duas placas de petri são limpas, cobertas com papel craft e amarradas com fio ou elástico (Figura 7.23). Este passo, assim como a esterilização das placas de petri no passo 6, são omitidos, se forem utilizadas placas de Petri esterilizadas por forno directamente.

2. Os ingredientes do meio de agar DNase (contendo o ADN como componente principal) ou o seu pó pronto para 100 ml do meio são pesados ​​e dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml, agitando e agitando.

3. O seu pH é determinado utilizando um papel de pH ou um medidor de pH e ajustado para 7, 2 utilizando HCl 0, 1 N se for mais ou utilizando NaOH 0, 1 N se for inferior.

4. O balão é aquecido para dissolver o ágar no meio completamente.

5. O frasco é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

6. As duas placas de petri e o frasco cônico contendo meio de ágar DNase são esterilizados a 121 ° C (15 psi de pressão) por 15 minutos em autoclave.

7. Após a esterilização, eles são removidos da autoclave e deixados esfriar por algum tempo, sem permitir que o meio solidifique. O resfriamento do meio evita a condensação e o acúmulo de gotículas de água dentro das placas. Se o meio já tiver sido preparado e solidificado durante o armazenamento, ele deve ser liquefeito aquecendo cuidadosamente até que derreta completamente.

8. Para preparar placas de agar DNase, antes que o meio de agar DNase esterilizado esfrie e solidifique, em estado quente fundido, é vertido assepticamente, preferencialmente dentro de uma câmara de fluxo laminar, nas duas placas de petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada), de forma que o meio derretido cobre completamente o fundo das placas de petri.

Em seguida, as placas são cobertas com as tampas e deixadas esfriar, de modo a solidificar o meio dentro delas. O vapor de água que pode condensar na superfície interna das placas e tampas é evaporado, mantendo as placas e tampas em posição invertida em uma incubadora a 37 ° C por cerca de 1 hora.

9. Cada placa é marcada no lado inferior em quatro trimestres.

10. A “inoculação pontual” das bactérias de teste é feita assepticamente, preferencialmente dentro de uma câmara de fluxo laminar, no centro de cada quarto, fazendo um ponto (ou pequeno esfregaço) das bactérias com a ajuda de um laço esterilizado por chama. O laço é esterilizado após cada inoculação.

11. As placas inoculadas são incubadas em posição invertida, de cima para baixo, a 37 ° C por 24 a 48 horas em uma incubadora até que as colônias das bactérias sejam visíveis.

12. As placas são inundadas com solução de ácido clorídrico IN (ou 0, 1% de azul de toluidina).

Observações:

1. Zonas claras transparentes (ou halo rosa) formadas ao redor de colônias: DNase positivo.

2. Zonas transparentes transparentes (ou halo rosa) não formadas ao redor de colônias: DNase negativa.