Cultivo de Bactérias de Amostras Sólidas, Líquidas e Secas (Com Figura)

Objetivo:

Os principais objetivos do cultivo de bactérias são os seguintes:

1. Aumentar o número de bactérias, de modo a obtê-las em formas visíveis, como colônias ou suspensões.

2. Isolamento de bactérias.

3. Manutenção de cultura pura e culturas padrão.

4. Enumeração de bactérias em amostras.

5. Detecção de bactérias particulares de interesse em uma amostra e sua enumeração.

6. Identificação de bactérias de características de colônia, características de crescimento em inclinações e atividades bioquímicas em diferentes meios.

No entanto, o objectivo desta experiência é apenas cultivar bactérias a partir de amostras líquidas, sólidas e superficiais em meios sólidos e líquidos, de modo a obtê-las em formas visíveis como colónias ou suspensões, respectivamente.

Princípio:

As bactérias são cultivadas em meio líquido ou sólido esterilizado e nutricionalmente rico. O meio líquido, chamado caldo, está contido em tubos de ensaio para formar 'tubos de caldo', enquanto o meio sólido, chamado meio de ágar, está contido em placas de petri para formar 'placas de ágar' ou simplesmente 'placas'. Cultivo de bactérias precisa de algum material, que é suspeito de conter bactérias.

A maioria das coisas que vemos contém bactérias. Eles estão presentes na raspagem de dentes, comida, solo, água, matéria fecal e até mesmo na própria mídia microbiológica não esterilizada. Uma quantidade definida da suspensão homogénea de qualquer material contendo bactérias é inoculada no meio esterilizado assepticamente e incubada numa incubadora a 37 ° C durante 24 horas.

No caldo líquido, as bactérias crescem em suspensão e tornam-se turvas. Em placas de ágar sólido, elas crescem como colônias; cada colônia crescendo a partir de uma única bactéria. Cultivo de bactérias é feito nos seguintes cinco passos.

1. Preparação de mídia

2. Esterilização de meios e peças de vidro

3. Inoculação

4. Incubação

5. Observação

1. Preparação de Mídia:

Normalmente, na preparação de caldo líquido e meio semi-sólido, os ingredientes são pesados nas proporções prescritas e dissolvidos na quantidade necessária de água. Atualmente, pós de mídia prontos contendo os ingredientes nas proporções necessárias estão disponíveis.

Na preparação de meio de caldo líquido, a quantidade prescrita de pó (como mencionado no rótulo da embalagem) é pesada e dissolvida na quantidade necessária de água num frasco cónico. Os ingredientes são dissolvidos por aquecimento, vertidos em tubos de ensaio e esterilizados em autoclave.

Mas na preparação de placas sólidas, inclinações e tubos profundos, a quantidade prescrita de pó (como mencionado no rótulo da embalagem) é pesada e dissolvida em quantidade necessária de água em um frasco cônico. Este meio preparado é primeiro esterilizado em autoclave e depois deixado esfriar por algum tempo.

Enquanto ainda está quente, antes de se solidificar, é colocado em placas de Petri esterilizadas ou em tubos de ensaio e deixado solidificar após arrefecimento até à temperatura ambiente. A mídia, em condição muito quente, nunca deve ser despejada em recipientes, pois leva à condensação de água na parede dos recipientes, que caem na superfície da mídia e podem levar à sua contaminação.

2. Esterilização:

As vidrarias são esterilizadas em estufa de ar quente a 180 ° C por 3 horas e em autoclave a 121 ° C (15 psi de pressão) por 15 minutos. As vidrarias também podem ser esterilizadas em autoclave, mas a mídia nunca deve ser esterilizada no forno, pois a água escapa da mídia e desidrata.

3. Inoculação:

Supõe-se que as amostras líquidas sejam suspensões homogêneas de bactérias. Portanto, para cultivo em caldo, um volume definido da amostra é pipetado no caldo de forma asséptica. Para cultivo em placas de agar, um volume definido da amostra é pipetado na placa de agar sólido e espalhado na superfície do meio de forma asséptica.

Para amostras sólidas, uma amostra de peso definido é homogeneizada assepticamente num volume definido de solução salina fisiológica normal (cloreto de sódio a 0, 85%) utilizando um pilão e almofariz esterilizados ou um misturador. A maioria dos patógenos humanos é isotônica ao corpo humano (cloreto de sódio a 0, 85%).

Normalmente, a proporção de amostra para solução salina é de 1: 9 (1g + 9 ml; 10g + 90 ml; 25g + 225 ml ou 50g + 450 ml). Um volume definido deste líquido homogeneizado, que é assumido como sendo uma suspensão homogénea de bactérias, é pipetado assepticamente para o caldo esterilizado em tubos de ensaio para cultura de caldo. Para cultura em placas de ágar, a suspensão líquida é pipetada na superfície das placas e espalhada assepticamente.

Para amostras de superfície tomadas para estudar a microbiologia de superfícies sólidas (tampos de mesa, superfícies corporais ou feridas), a superfície é esfregada com um cotonete esterilizado. O cotonete é tocado na superfície de uma placa de ágar esterilizada. A partir do ponto de toque, as estrias são feitas por laço esterilizado assepticamente, de modo a isolar as bactérias.

4. Incubação:

Os tubos e placas de caldo inoculados são incubados a 37 ° C durante 24 horas numa incubadora.

5. Observação:

Turbidez no caldo líquido e colônias em placas de ágar indicam crescimento de bactérias.

Material Requerido:

Placas de Petri (6 nos), pipetas de 2 ml (5 nos), tubos de ensaio (5 nos), frascos cônicos (100 ml, 250 ml e 500 ml-l cada), copo de 250 ml (2 nos), vidro Espalhador, caixa de pipetas em aço inoxidável, papel craft, fio (ou elástico), algodão não absorvente, palitos, laço, álcool etílico, cloreto de sódio (NaCl), ácido clorídrico 0, 1 N (HCI), 0, 1N hidróxido de sódio (NaOH ), água destilada, caldo nutriente, ágar nutriente, amostra líquida (por exemplo água do lago), amostra sólida (por exemplo, solo), amostra de superfície (por exemplo, tampo de mesa, superfície corporal, ferida), papel de pH (ou medidor de pH) (ou homogeneizador), bico de bunsen, estufa de ar quente, autoclave, incubadora, câmara de fluxo laminar.

Procedimento:

1. Cinco pipetas (em uma caixa de pipetas de aço inoxidável), seis placas de petri e um pilão e almofariz (ou um copo de homogeneizador) são esterilizados a 180 ° C por 3 horas em um forno de ar quente. Alternativamente, eles podem ser cobertos com papel ofício, amarrados com fio ou elástico e esterilizados em autoclave junto com o meio (Figura 6.1).

2. 0, 85 g de NaCl são dissolvidos em 100 ml de água destilada num copo de 250 ml e 90 ml desta solução salina são vertidos para um balão cónico de 100 ml. A boca é de algodão, coberta com papel ofício e amarrada com fio ou elástico.

3. Os ingredientes do meio de caldo nutriente necessário para 100 ml do caldo são pesados. Alternativamente, a quantidade prescrita de pó de caldo nutriente pronto (mistura de ingredientes) é pesada.

4. Os ingredientes (ou o pó pronto a preparar) são dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml, agitando e agitando. Seu pH é determinado usando um papel de pH ou medidor de pH. O pH é ajustado para 7, 0 usando HCl 0, 1 N se é mais ou usando NaOH 0, 1 N se for menor. O frasco é aquecido, se necessário, para dissolver completamente os ingredientes.

5. O caldo é distribuído em 5 tubos de ensaio (aproximadamente 10 ml cada), com a boca tapada com algodão, coberta com papel craft e amarrada com fio ou elástico.

6. Os ingredientes do meio nutriente ágar ou do seu pó pronto para perfazer 200 ml de meio são pesados e dissolvidos em 200 ml de água destilada num balão cónico de 500 ml, agitando e agitando.

O seu pH é determinado usando um papel de pH ou medidor de pH e ajustado para 7, 0 usando HC1 0, 1 N se for mais ou usando NaOH 0, 1 N se for menor. O frasco é aquecido para dissolver completamente o ágar no meio. Em seguida, é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

7. As zaragatoas são feitas torcendo o algodão em torno das pontas dos pequenos gravetos. Poucos desses swabs são mantidos em um tubo de ensaio com as pontas de algodão para baixo. O tubo de ensaio é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

8. O frasco cónico de 100 ml com 90 ml de solução salina, os 5 tubos de ensaio com caldo nutriente, o frasco cónico de 500 ml contendo 200 ml de meio nutriente e o tubo de ensaio contendo os esfregaços são esterilizados a 121 ° C (15 psi 15 minutos em autoclave.

9. Após a esterilização, os materiais esterilizados são removidos da autoclave e deixados a arrefecer durante algum tempo, sem permitir que o meio solidifique. O resfriamento do meio evita a condensação e o acúmulo de gotículas de água dentro das placas. Se o meio já tiver sido preparado e solidificado durante o armazenamento, ele deve ser liquefeito aquecendo cuidadosamente até que derreta completamente.

10. Para preparar as placas de ágar nutriente, antes que o meio de nutriente esterilizado resfrie e solidifique, em estado de fusão quente, é despejado assepticamente, nas 6 placas de petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada), para que o meio fundido cubra a parte inferior as placas de petri completamente.

Em seguida, as placas são cobertas com as tampas e deixadas esfriar, de modo a solidificar o meio dentro delas. O vapor de água que pode condensar na superfície interna das placas e tampas é evaporado, mantendo as placas e tampas em posição invertida em uma incubadora a 37 ° C por cerca de 1 hora.

11. A amostra líquida (suspeita de conter bactérias, por exemplo, água da lagoa) é retirada. Um ml de cada uma das amostras é pipetado assepticamente para 2 tubos de caldo (Figura 6.2). Os tubos são redemoinhos. A amostra líquida também é pipetada assepticamente em placas de 2 agar, 0, 1 ml cada, e espalhada na superfície do meio ágar usando um espalhador de vidro esterilizado por chama.

Antes de se espalhar pelo difusor de vidro, é mergulhado em álcool e inflamado sobre um bico de bunsen. Os tubos e placas de caldo inoculados são incubados a 37 ° C durante 24 horas numa incubadora. As placas são incubadas em posição invertida, de cima para baixo.

12. Para a amostra sólida (por exemplo, terra), 10 g da amostra são assepticamente pesados e homogeneizados no pilão esterilizado e no copo de almofariz ou homogeneizador após a adição de 90 ml da solução salina esterilizada do frasco cónico de 100 ml.

Esta suspensão de bactérias homogéneas é pipetada assepticamente para 2 tubos de caldo e 2 placas de agar como no passo 11 e incubada a 37 ° C durante 24 horas na incubadora (Figura 6.2). As placas são incubadas em posição invertida, de cima para baixo.

13. Para amostragem de superfície, a superfície suspeita de conter bactérias (tampo de mesa, superfície do corpo, ferida) é marcada para uma área unitária (por exemplo, 1 cm ² ), que é esfregada por um esfregão esterilizado. O cotonete é tocado na superfície das duas placas de ágar deixadas de fora.

A crosta é feita assepticamente por um laço esterilizado por chama. Para estrias, linhas quase paralelas são desenhadas pelo laço do ponto de toque do cotonete. Estes formam as faixas principais. Após a esterilização por chama da alça, as estrias secundárias são desenhadas quase na diagonal para as estrias primárias. De maneira semelhante, as estrias terciárias e quaternárias são feitas de forma asséptica.

14. Em seguida, as placas são incubadas em posição invertida, de cima para baixo, a 37 ° C por 24 horas na incubadora (Figura 6.2).

15. Uma placa de ágar não inoculada e um tubo de caldo não inoculado são incubados como controlo para assegurar a esterilização adequada como indicado por nenhum crescimento neles. Este passo é opcional.