Bactérias presentes em uma amostra pelo método de chapeamento de ágar de diluição em série ou método de contagem de placa total (TPC)

Contagem Total de Placas (TPC):

Enumerar as bactérias presentes em uma amostra pelo método de placa de diluição serial ou pelo método de contagem total de placas (TPC).

Objetivo:

A extensão da atividade bacteriana em uma determinada amostra em um conjunto definido de condições depende principalmente do número total de bactérias presentes, independentemente de sua espécie.

Portanto, muitas vezes é necessário descobrir o número total de bactérias presentes em amostras de alimentos, água, solo, ar e tecido durante sua análise microbiológica. Esse número total de bactérias inclui bactérias vivas e mortas. Bactérias mortas não podem crescer e se reproduzir.

São apenas as bactérias vivas (bactérias viáveis), que podem crescer e se multiplicar, resultando em atividade bacteriana específica. Portanto, muitas vezes é necessário enumerar as células de bactérias viáveis ​​em diferentes amostras. No entanto, a maioria dos métodos de enumeração como contagem microscópica direta, contagem de células eletrônicas, métodos químicos e método espectrofotométrico contam células tanto vivas quanto mortas.

Esses métodos não podem discriminar entre células vivas e mortas. Por conseguinte, o método de revestimento em ágar-diluição em série, que enumera apenas as células de bactérias viáveis, é o método universalmente utilizado para contagem de células vivas viáveis ​​em diferentes amostras.

Princípio:

Um peso definido de amostra sólida é homogeneizado assepticamente em nove volumes de solução salina estéril para obter uma suspensão homogênea de bactérias. A amostra líquida é usada diretamente como suspensão homogênea de bactérias. As suspensões de bactérias assim obtidas são diluídas em série (10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, etc.). Aqui 10 ^-1, 10 ^-2, 10 ^-3 etc. são chamados de diluições.

Seus recíprocos (10 ¹, 10 ², 10 ³ etc.) são chamados de fatores de diluição. Um volume definido de suspensão de bactérias de cada diluição é inoculado em placas de ágar e espalhado apropriadamente, de forma a separar as células individuais das bactérias e isolá-las umas das outras.

A inoculação de bactérias para sua enumeração é feita de duas maneiras:

1. Derrame a técnica da placa

2. Técnica de placa de espalhamento

1. Derrame a técnica da placa:

Nesta técnica, 1 ml da suspensão de bactérias é colocado em uma placa de Petri esterilizada e, em seguida, derrama-se o meio de agar nutriente liquefeito sobre ele. A placa de petri é rodada suavemente, de modo a permitir que a suspensão se misture uniformemente com o meio. É permitido esfriar e solidificar.

2. Técnica de Placa de Propagação:

Nesta técnica, colocam-se 0, 1 ml da suspensão de bactérias numa placa de ágar preparada. Então, a gota de suspensão é espalhada uniformemente na placa de ágar por um espalhador de vidro esterilizado.

Para minimizar o erro, cada suspensão diluída é colocada em placas de 2-5 réplicas. As placas inoculadas são incubadas a 37 ° C durante 24 horas. Durante este período, cada célula bacteriana individual isolada na placa de ágar cresce e multiplica-se rapidamente para produzir uma massa macroscópica visível de células bacterianas chamada "colônia". Assim, o número de colônias na placa representa o número de bactérias na amostra.

No entanto, muitas vezes, durante a disseminação, algumas células podem não ser separadas adequadamente e poucas dessas células não separadas podem originar uma única colônia. Além disso, poucas células têm tendência a permanecer em pares, cadeias ou aglomerados.

Aqui, cada par, corrente ou cluster produz uma colônia. Assim, cada colônia, em sentido estrito, não representa uma única bactéria. É por isso que, em vez de expressar a contagem de bactérias como 'Não' de bactérias / gm ou ml de amostra ', é muitas vezes expresso como número de unidades formadoras de colónias por gm ou ml (CFU / gm ou ml).

A contagem total de placas (TPC) na amostra original é calculada multiplicando o número de CPUs pelos respectivos fatores de diluição. As "regras de enumeração" são seguidas, ao calcular o número de bactérias na amostra original.

Materiais requisitados:

Placas de Petri (15 nos), pipetas de 2 ml (10 nos), pipeta de 10 ml (1 n), tubos de ensaio (10 ns), frascos cónicos (500 ml e 1 litro-1 n de cada), Copo de 500 ml (2 nos.), Espalhador de vidro, caixa de pipetas de aço inoxidável, papel craft, fio (ou elástico), algodão não absorvente, álcool etílico, cloreto de sódio (NaCl), ácido clorídrico 0, 1 N (HCI), Hidróxido de sódio 0, 1N (NaOH), água destilada, ágar nutriente, amostra líquida (por exemplo, água da lagoa / água de esgoto), amostra sólida (por exemplo, solo / carne de peixe / carne de ostra / alimentos processados), papel pH (ou medidor de pH) e argamassa (ou homogeneizador), queimador de bunsen, forno de ar quente, autoclave, incubadora, câmara de fluxo laminar, contador de colónias de Quebec.

Procedimento:

1. Dez pipetas (em uma caixa de pipetas de aço inoxidável), 15 placas Petri e um pilão e almofariz (ou um copo homogeneizador) são esterilizados em forno de ar quente a 180 ° C por 3 horas. Alternativamente, eles podem ser cobertos com papel craft, amarrados com fio ou elástico e esterilizados em autoclave junto com o meio (Figura 6.6).

O número de placas de Petri e, consequentemente, a quantidade de meio a ser utilizado é calculada dependendo do número de replicações e diluições necessárias. Aqui, o material de vidro e o meio foram levados para replicação única e diluição até 10 ^-6 . O número de utensílios de vidro e a quantidade de meio utilizado para a esterilização é um pouco maior para evitar qualquer erro incidental, porque a esterilização é um processo demorado.

2. Dissolvem-se 4, 25 g de NaCl em 500 ml de água destilada para obter solução salina fisiológica (0, 85%). 225 ml desta solução salina são vertidos para um frasco cónico de 500 ml. Sua boca é de algodão, coberta com papel ofício e amarrada com fio ou elástico. É usado como os primeiros diluentes para diluir a amostra sólida.

3. 9, 0 ml da solução salina também é pipetada para cada um dos 10 tubos de ensaio. Suas bocas são de algodão, cobertas com papel craft e amarradas com fio ou elástico. Estes são utilizados como diluentes para diluição em série.

4. Os ingredientes do meio nutriente ágar ou do seu pó pronto a usar, necessários para 500 ml de meio, são pesados ​​e dissolvidos em 500 ml de água destilada num balão cónico de 1 litro, agitando e agitando.

O seu pH é determinado usando um papel de pH ou medidor de pH e ajustado para 7, 0 usando HC1 0, 1 N se for mais ou usando NaOH 0, 1 N se for menor. O frasco é aquecido para dissolver completamente o ágar no meio. Em seguida, é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

5. O frasco cónico de 500 ml contendo 225 ml de solução salina, os 10 tubos de ensaio contendo 9 ml de solução salina e o frasco cónico de 1 litro contendo 500 ml de meio nutriente ágar são esterilizados a 121 ° C (15 psi pressão) durante 15 minutos em autoclave.

6. Após a esterilização, os materiais esterilizados são removidos da autoclave e deixados a arrefecer durante algum tempo, sem permitir que o meio solidifique. O resfriamento do meio evita a condensação e o acúmulo de gotículas de água dentro das placas. Se o meio já tiver sido preparado e solidificado durante o armazenamento, ele deve ser liquefeito aquecendo cuidadosamente até que derreta completamente.

7. Para preparar as placas de ágar, antes que o meio de nutriente esterilizado resfrie e solidifique, em estado de fusão quente, é vertido assepticamente nas 6 placas de petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada), de forma que o meio derretido cubra o fundo da placa de Petri. Pratos completamente.

Em seguida, as placas são cobertas com as tampas e deixadas esfriar, de modo a solidificar o meio dentro delas. O vapor de água que pode condensar na superfície interna das placas e tampas é evaporado, mantendo as placas e tampas em posição invertida em uma incubadora a 37 ° C por cerca de 1 hora.

8. 25 g da amostra sólida (por exemplo, carne de peixe / carne de ostra / alimento processado) são pesados ​​e homogeneizados em 225 ml de solução salina esterilizada (diluente) assepticamente (Figura 6.7). Isto dá uma diluição de 10 vezes (diluição = 10 ^-1 ). Para a amostra líquida, 1 ml de amostra é pipetado assepticamente para um tubo salino esterilizado de 9 ml. Isto também dá uma diluição de 10 vezes (diluição = 10 ^-1 ).

9. 1 ml da diluição de 10 ^-1 é transferido para 9 ml de solução salina esterilizada noutro tubo de ensaio. Isto dá 100 vezes a diluição (diluição = 10 ^-2 ). A partir da diluição ^10-2, 1 ml é introduzido numa placa de Petri esterilizada e 0, 1 ml numa placa de agar, a partir da mesma pipeta. Para cada diluição é utilizada uma pipeta esterilizada separada. Após o uso, é mergulhado no frasco de descarte.

10. 1 ml da diluição ^10-2 é transferido para 9 ml de solução salina esterilizada noutro tubo de ensaio. Isto dá uma diluição de 1000 vezes (diluição = 10 ^-3 ). A partir da diluição ^10-3, 1 ml é introduzido numa placa de Petri esterilizada e 0, 1 ml numa placa de agar, a partir da mesma pipeta. De um modo semelhante, a diluição continua até 10 ^{-6 em} série, transferindo cada vez 1 ml para uma placa de petri esterilizada e 0, 1 ml para uma placa de ágar da mesma pipeta.

11. Em seguida, as gotas de suspensão nas placas de ágar são espalhadas assepticamente por um espalhador de vidro esterilizado. Depois de espalhar em cada placa, é esterilizado por chama mergulhando em álcool e mostrando sobre uma chama. Esta é a técnica da placa de propagação.

12. As placas de petri contendo 1ml de suspensão de bactérias são tomadas e esterilizado em Ágar liquefeito de nutrientes é derramado neles. Eles são rodados suavemente, de modo a permitir que a suspensão se misture uniformemente com o meio. As placas são deixadas a arrefecer até o meio solidificar. Esta é a técnica de 'pour plate'.

13. Em seguida, as placas são incubadas em posição invertida, de cima para baixo, a 37 ° C por 24 horas em uma incubadora (Figura 6.7).

14. Uma placa de ágar não inoculada é incubada como controle para garantir a esterilização adequada, como mostrado por nenhum crescimento sobre ela.

Observações:

O número de colônias de bactérias nas placas é contado diretamente ou com a ajuda de um contador de colônia de Quebec. A partir disso, calcula-se o número de bactérias presentes por grama ou ml da amostra original. Isso é chamado de enumeração.

Regras de enumeração:

1. As placas de Petri com 30 a 300 colônias devem ser consideradas.

2. Os números médios de duplicados e triplicados (R ₁, R ₂ R ₃ …) são considerados apenas se uma contagem não for mais do que o dobro da outra. Se um é mais que o dobro do outro valor mais baixo é tomado.

3. Para a técnica pour plate, a contagem bacteriana é No.X 10 ^c / g, onde c = fator de diluição. Para a técnica de placa de dispersão, a contagem de bactérias é No. X10 ^{c + 1} / g, onde c = fator de diluição. O número é convertido em duas casas decimais na forma de (x.yz X 10 ^m ). Por exemplo, 288 X 10 ⁴ é expresso como 2, 88 x 10 ⁶ .

4. Se, em todas as diluições, o número de colónias for superior a 300, conte para a maior diluição e se, em todas as diluições, for inferior a 30, a contagem para a menor diluição é considerada. Em ambos os casos, a contagem é representada como: Estimated No. X 10 ^c / g ou ml para a técnica de placa de vazamento e Estimated No. X 10 ^{c + 1} / g ou ml para a técnica de placa de espalhamento.

5. Se nenhuma colônia é observada em qualquer diluição tomada, ela é representada como: Estimada <1 x menor diluição.

6. Como a diluição serial ocorre em termos de 10 vezes, matematicamente é óbvio que duas diluições não podem ter colônias entre 30 e 300. Por exemplo, se ^10-3 tem 50 colônias, 10 ^-2 deve ter 500 (ie> 300) e 10 ^-4 devem ter 5 (ou seja, <30) colônias.

No entanto, isso não ocorre na realidade, pois as bactérias não ocorrem como uma solução homogênea; em vez disso, ocorre como uma suspensão nos diluentes. Se houver duas diluições tendo colônias contáveis ​​(entre 30 e 300), primeiro calcule o número de unidades formadoras de colônias / gm ou ml usando cada diluição.

Se um valor for mais que o dobro do outro, relate o valor mais baixo. Se não, tome a média dos dois valores e relate esse valor.