Objetivo de isolar bactérias diferentes presentes em uma determinada amostra e manter suas culturas puras

Objetivo de isolar diferentes bactérias presentes em uma determinada amostra e manter suas culturas puras.

Objetivo:

Bactérias encontradas na natureza, não ocorrem como espécies segregadas, mas ocorrem como populações mistas de diferentes espécies.

Portanto, para estudar as espécies individuais de bactérias, primeiro é necessário separá-las da população mista. Esse processo é chamado de "isolamento de bactérias".

Isto é conseguido através do crescimento da população mista de bactérias na superfície de um meio sólido em colónias discretas. 'Colônias' são massas de bactérias individuais, macroscopicamente visíveis, crescidas na superfície de meio sólido, cada uma representando a multiplicação de uma única bactéria.

Como cada colônia vem do crescimento e multiplicação repetida de uma única bactéria, todas as bactérias presentes na colônia pertencem à mesma espécie. Assim, cada colônia representa uma população muito grande de uma única espécie de bactéria.

Estas colônias são transferidas assepticamente para separar agar nutriente inclinado e permitido crescer lá. As espécies isoladas de bactérias, cultivadas separadamente em agar slants são chamadas de "culturas puras". A cada 15 a 30 dias, eles são transferidos para novas inclinações, para que não percam suas características originais devido ao superpopulação, à falta de nutrientes e ao acúmulo de metabólitos.

Deste modo, culturas de bactérias puras são mantidas em laboratório por transferência repetida para inclinações frescas em intervalos regulares. Este processo é conhecido como "manutenção da cultura pura". Culturas puras são mantidas em laboratório para sua posterior identificação por várias técnicas de coloração, bioquímicas, sorológicas e moleculares, bem como para seu uso futuro.

'Culturas de estoque' são culturas puras padrão, cuja identificação foi estabelecida internacionalmente para gênero, espécie, sub-espécie, tipo ou nível de subtipo. Eles são mantidos em laboratórios de microbiologia reconhecidos internacionalmente.

Outros laboratórios podem obtê-los a partir desses laboratórios e manter em seus próprios laboratórios como culturas de estoque, por transferência repetida para declives frescos em intervalos regulares. Eles são usados para a identificação confirmada de culturas puras obtidas nesses laboratórios pela comparação de suas características com as culturas de estoque padrão.

Princípio:

A população mista de bactérias presentes em um determinado material (sólido, líquido ou superfície) é cultivada em placas de ágar nutriente pelo método de placa de espalhamento ou placa de linha como descrito anteriormente em 'Cultivation of bacteria'. Cada colônia isolada encontrada em uma placa de ágar consiste de uma espécie de bactéria, pois cada colônia cresce a partir de uma única bactéria.

Assim, as bactérias são isoladas em placas de agar por duas técnicas, como segue:

(a) Técnica de placa de espalhamento

b) Técnica da placa de riscos

Colônias representativas (colônias com características dissimilares) são selecionadas e assepticamente inoculadas para separar agar slants para obter as culturas puras. Após cada 15 a 30 dias, eles são transferidos para novas inclinações para manutenção dessas culturas puras.

Materiais requisitados:

Tubos de ensaio (5 nos), frasco cônico de 250 ml (1 não), NaOH 0, 1 N, HCl 0, 1 N, água destilada, ágar nutriente, algodão não absorvente, alça, papel craft, fio (ou elástico), papel pH (ou medidor de pH), bico de bunsen, autoclave, câmara de fluxo laminar, incubadora, placas contendo colônias isoladas de bactérias (placa de espalhamento ou placa em linha).

Procedimento:

1. Os ingredientes do meio nutriente ágar ou o seu pó pronto a perfazer, necessário para 100 ml de meio, são pesados e dissolvidos em 100 ml de água destilada, num balão cónico de 250 ml, agitando e agitando (figura 6.4).

2. Seu pH é determinado usando um papel de pH ou medidor de pH e ajustado para 7, 0 usando HC1 0, 1N se é mais ou usando NaOH 0, 1N se for menor.

3. O balão é aquecido para dissolver completamente o ágar no meio.

4. Antes de solidificar, o meio em estado de fusão quente é distribuído em 5 tubos de teste (aproximadamente 20 ml cada).

5. Os tubos de ensaio são revestidos de algodão, cobertos com papel craft e amarrados com fio ou elástico.

6. Eles são esterilizados a 121 ° C (15 psi de pressão) por 15 minutos em autoclave.

7. Após a esterilização, eles são removidos da autoclave e mantidos em uma posição inclinada para resfriar e solidificar o meio. Estes tubos de ensaio contendo meio agar nutriente solidificado em condições inclinadas são chamados de "agar nutriente inclinado".

8. Os passos 10 e 11 devem ser realizados seguindo técnica asséptica, preferencialmente em uma câmara de fluxo laminar. A boca dos recipientes contendo mídia ou culturas esterilizadas deve ser mostrada sobre a chama do bico de Bunsen após a remoção do plugue de algodão e antes de colocá-lo de volta.

Laços, antes do uso, devem ser esterilizados sobre a chama por aquecimento até ficarem vermelhos e, em seguida, resfriados por 30 segundos para esfriar até a temperatura ambiente. Eles nunca devem ser usados quando estão muito quentes, pois eles matam os micróbios quando os tocam.

9. No experimento anterior, se colônias isoladas pudessem ser observadas na placa de espalhamento ou na placa da linha, cinco colônias com características diferentes são selecionadas como colônias representativas.

10. Uma alça é esterilizada sobre a chama e uma alça de bactérias de cada uma das colônias representativas é tomada assepticamente. O loop é introduzido no ágar inclinado, de modo que o loop de bactérias vai para o final da inclinação. O laço é movido para fora de uma maneira ondulada, tocando a superfície da inclinação, de modo que uma linha ondulada é formada.

11. O laço é esterilizado por chama e, de maneira semelhante, o restante das quatro colônias representativas é inoculado separadamente na esquerda, sobre quatro inclinações. O laço é esterilizado após cada inoculação.

12. As cinco lâminas inoculadas são incubadas a 37 ° C por 24 horas em uma incubadora.

Observações (Características Culturais):

(i) Uma linha ondulada com crescimento ao longo de seu comprimento observado:

O crescimento ocorreu.

A inclinação é observada para características inclinadas como segue (Figura 6.5).

1. Abundância de Crescimento:

A quantidade de crescimento é designada como nenhuma, pequena, moderada ou grande.

2. Pigmentação:

Microrganismos cromogênicos podem produzir pigmentos intracelulares que são responsáveis pela coloração do organismo, como visto em colônias superficiais. Outros organismos produzem pigmentos solúveis extracelulares que são excretados no meio e também produzem uma cor. A maioria dos organismos, no entanto, não é cromomérica e aparecerá branca a cinza.

3. Características Ópticas:

As características ópticas podem ser avaliadas com base na quantidade de luz transmitida através do crescimento.

Essas características são descritas como:

(uma) Opaco: sem transmissão de luz.

b) Translúcido: Transmissão de luz parcial.

c) Transparente: transmissão de luz total.

4. Forma:

A aparência da linha de crescimento de linha única na superfície do agar é designada da seguinte forma:

(uma) Filiforme: Crescimento contínuo, semelhante a linhas, com bordas lisas.

b) Echinulate: crescimento contínuo, threadlike com bordas irregulares.

c) Frisado: Colônias não confluentes a semi-confluentes.

d) Effuse: crescimento fino e disseminado.

e) Arborescente: crescimento semelhante a uma árvore.

(f) Rhizoid: crescimento semelhante a raiz.

(ii) Nenhum Crescimento ao Longo da Linha de Inoculação:

Falha técnica de inoculação, Inoculação é repetida C Enumeração de bactérias.

C. Enumeração de Bactérias:

A extensão da atividade bacteriana em uma determinada amostra em um conjunto definido de condições depende principalmente do número total de bactérias presentes, independentemente de sua espécie. Portanto, muitas vezes é necessário descobrir o número total de bactérias presentes em amostras de alimentos, água, solo, ar e tecido durante sua análise microbiológica.

Estimar o número de bactérias em uma determinada amostra é chamado de 'enumeração de bactérias'. Existem vários métodos de enumeração de bactérias, conforme indicado abaixo. Todos esses métodos precisam que as bactérias estejam presentes em uma suspensão homogênea.

É por isso que amostras líquidas são consideradas suspensões homogêneas de bactérias e são usadas diretamente, enquanto amostras sólidas são homogeneizadas em soluções salinas estéreis, de modo a obter suspensões homogêneas de bactérias.

Não usado comumente:

(I) Métodos Diretos:

(a) Contagem microscópica direta

(b) Contador de células eletrônicas

(II) Métodos Indiretos:

c) Métodos químicos

d) Método turbidimétrico

e) Contagem do filtro de membrana

Mais amplamente utilizados:

(f) Método de dilatação em ágar-ágar em série ou Método de contagem total em placa (método TPC)

(a) Contagem Microscópica Direta:

Neste método, o número de bactérias presentes numa alíquota da suspensão homogénea de bactérias é contado directamente ao microscópio e o número total de bactérias na amostra é determinado matematicamente.

A vantagem deste método é que é muito rápido. As desvantagens são que as células vivas e mortas são contadas e o método não é sensível a populações com menos de um milhão de bactérias por mililitro.

A contagem pode ser feita de duas maneiras, da seguinte maneira:

(i) Câmara Petroff-Hauser:

É uma câmara de contagem especializada, na qual uma alíquota da suspensão homogênea de bactérias é colocada para contar diretamente sob um microscópio.

ii) esfregaço da raça:

Células de bactérias são contadas diretamente ao microscópio usando esfregaços manchados confinados a uma área de 1 mm ² na lâmina. É usado principalmente para a enumeração de bactérias no leite.

(b) Contador Eletrônico de Células:

Um contador de células eletrônicas, como "Contador de Coulter", é usado para contar diretamente o número de células de bactérias. Uma suspensão homogênea de células bacterianas preparadas em um fluido condutor é permitida passar através de um minúsculo orifício, através do qual uma corrente elétrica flui.

A resistência no orifício é registrada eletronicamente. Quando uma célula passa pelo orifício, sendo não-condutor, aumenta momentaneamente a resistência. O número de vezes que a resistência aumenta momentaneamente é registrada eletronicamente, o que indica o número de bactérias presentes na suspensão.

A vantagem deste método é que é extremamente rápido. As desvantagens são que as células vivas e mortas são contadas e o instrumento não consegue distinguir entre células de bactérias e partículas inertes.

c) Métodos químicos:

Esses métodos estimam a quantidade dessas substâncias, principalmente químicas, que aumenta com o aumento da população bacteriana.

Os principais parâmetros estimados são os seguintes:

i) Concentração de proteínas

(ii) concentração de DNA

iii) Peso seco

iv) Produção de dióxido de carbono

(v) absorção de oxigênio

(vi) produção de ácido láctico

d) Método turbidimétrico:

Quando as bactérias são cultivadas em meio líquido rico em nutrientes (por exemplo, caldo de nutrientes), seu crescimento profuso torna a mídia turva, já que as células bacterianas permanecem suspensas nelas. A turbidez aumenta com o aumento do número de células na mídia. À medida que a turbidez aumenta, a "absorbância" ou "densidade óptica (OD)" da mídia aumenta.

A OD da suspensão de células bacterianas no meio é medida usando um espectrofotômetro a 600 nm. O nï¿½ero de cï¿½ulas de bactï¿½ias na suspensï¿½ ï¿½descoberto por comparaï¿½o da DO com uma curva padrï¿½ preparada representando graficamente os valores de DO para diferentes concentraï¿½es conhecidas de bactï¿½ias. O método é rápido, mas limitado a suspensões bacterianas de mais de 10 milhões de células.

(e) Contagem do Filtro de Membrana:

Este método é usado quando o número de bactérias em uma amostra líquida é muito menor. Para aumentar a concentração de bactérias, primeiro a amostra líquida é filtrada assepticamente através de um aparelho de filtro de membrana esterilizado usando um filtro de membrana estéril.

O filtro de membrana contendo as bactérias retidas é transferido assepticamente para uma placa de petri estéril contendo uma almofada absorvente saturada com um meio líquido diferencial seletivo. O meio escorre para a superfície do filtro. Após a incubação, o número de colônias formadas no filtro é contado usando um simples microscópio.