Teste de urease em bactérias para descobrir sua capacidade de hidrolisar a uréia (com figura)

Teste de urease em bactérias para descobrir sua capacidade de hidrolisar a uréia (com figura)!

Princípio:

Algumas bactérias têm a capacidade de hidrolisar (degradação na presença de água) a ureia em NH ₃ e CO ₂, uma vez que podem produzir a enzima urease.

NH ₃ é alcalino (básico), devido ao qual, aumenta o pH mudando a cor do vermelho de fenol de amarelo para rosa.

No teste da urease, as bactérias de teste são cultivadas em agar slants contendo uréia e vermelho de fenol. Se as bactérias têm a capacidade de hidrolisar a ureia, a cor do meio muda de amarelo para rosa. Algumas bactérias podem produzir NH ₃ quebrando as peptonas no meio. Em tais casos, um resultado falso positivo é obtido.

Materiais requisitados:

Tubos de ensaio, frasco cônico, tampões de algodão, agulha de inoculação, autoclave, bico de bunsen, câmara de fluxo laminar, jarra de descarte, incubadora, aparelho de filtração por membranas, ágar ureia, colônias isoladas ou culturas puras de bactérias.

Procedimento:

1. Cinco tubos de ensaio são revestidos de algodão, cobertos com papel craft e amarrados com fio ou elástico (Figura 7.15).

2. Os ingredientes do meio de agar ureico (contendo a ureia como componente principal) ou o seu pó pronto a preparar (excepto a ureia) necessário para 100 ml do meio são pesados e dissolvidos em 90 ml de água destilada num frasco cónico de 250 ml. agitando e girando.

3. Seu pH é determinado usando um papel de pH ou medidor de pH e ajustado para 6, 9 usando 0, 1 N de HCl se é mais ou usando 0, 1N NaOH se for menor.

4. O balão é aquecido para dissolver o ágar no meio completamente.

5. O frasco é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

6. Os cinco tubos de ensaio e o frasco cônico contendo ágar de ureia (exceto uréia) são esterilizados a 121 ° C (15 psi de pressão) por 15 minutos em autoclave.

7. Após a esterilização, eles são removidos da autoclave e deixados esfriar por algum tempo sem permitir que o meio solidifique. O resfriamento do meio evita a condensação e o acúmulo de gotículas de água nas inclinações. Se o meio já tiver sido preparado e solidificado durante o armazenamento, ele deve ser liquefeito aquecendo cuidadosamente até que derreta completamente.

8. Prepara-se 20% de solução de ureia dissolvendo 20 gramas de ureia em 100 ml de água destilada e é esterilizada por aparelho de filtração por membrana, porque a ureia não pode ser esterilizada pelo calor, pois se decompõe por aquecimento.

9. 10 ml da solução de ureia esterilizada são misturados assepticamente com 90 ml do meio liquefeito refrigerado esterilizado (liquefeito por aquecimento).

10. Antes de se solidificar, o meio, em estado de fusão quente, é distribuído assepticamente nos 5 tubos de ensaio esterilizados (aproximadamente 20 ml cada).

11. Os tubos de ensaio são mantidos numa posição inclinada para arrefecer e solidificar o meio, de modo a obter agar de ureia inclinada.

12. A bactéria de teste é inoculada assepticamente, preferivelmente em uma câmara de fluxo laminar, nas inclinações, apunhalando na bunda e riscando na superfície das lâminas com a ajuda de uma agulha esterilizada por chama. A agulha é esterilizada após cada inoculação.

13. As lâminas inoculadas são incubadas a 37 ° C por 24 horas em uma incubadora.