Teste de hidrólise lipídica em bactérias para descobrir sua capacidade de hidrolisar lipídios (com figura)

Leia este artigo para aprender sobre o teste de hidrólise lipídica, para descobrir a capacidade de uma bactéria hidrolisar os lipídios (gorduras)!

Princípio:

Algumas bactérias têm a capacidade de hidrolisar lipídios (gorduras) a glicerol e ácidos graxos, pois possuem a enzima lipolítica 'lipase'.

Essas bactérias são chamadas de bactérias lipolíticas. Enquanto os lípidos formam uma emulsão, quando dispensados em ágar, produzindo opacidade, os seus produtos finais hidrolisados, glicerol e ácidos gordos, não formam essa emulsão com ágar, para o qual não produzem essa opacidade; em vez disso, produzir transparência.

No teste de hidrólise lipídica, as bactérias de teste são cultivadas em placas de ágar contendo tributirina como substrato lipídico. A tributirina forma uma emulsão, quando dispensada no ágar, produzindo um meio opaco.

Se a bactéria tem a capacidade de hidrolisar lipídios, suas colônias hidrolisam a tributirina no meio nas áreas ao seu redor para glicerol solúvel e ácidos graxos (ácido butírico), enquanto o resto das áreas das placas contêm tributirina não hidrolisada.

Como resultado, zonas claras transparentes são formadas ao redor das colônias, já que os produtos hidrolisados, glicerol e ácidos graxos, formados ao redor deles, não formam emulsão com o ágar. Por outro lado, as demais áreas das placas permanecem opacas, pois a tributirina não hidrolisada nessas áreas forma uma emulsão com o ágar.

Materiais requisitados:

Placas de Petri, frasco cônico, plugues de algodão, alça de inoculação, autoclave, bico de bunsen, câmara de fluxo laminar, frasco descartável, incubadora, agar tributyrin, colônias isoladas ou culturas puras de bactérias.

Procedimento:

1. Duas placas de petri são limpas, cobertas com papel craft e amarradas com fio ou elástico (Figura 7.22). Este passo, assim como a esterilização das placas de petri no passo 6, são omitidos, se forem utilizadas placas de Petri esterilizadas por forno directamente.

2. Os ingredientes do meio de agar de tributirina (excluindo a tributirina, que é o componente lipídico) ou o seu pó pronto necessário para 100 ml do meio são pesados e dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml, agitando e rodando.

3. O seu pH é determinado utilizando um papel de pH ou um medidor de pH e ajustado para 7, 2 utilizando HCl 0, 1 N se for mais ou utilizando NaOH 0, 1 N se for inferior.

4. O balão é aquecido para dissolver o ágar no meio completamente.

5. Após o resfriamento a cerca de 90 ° C, a tributirina é adicionada e emulsionada em um liquidificador em guerra.

6. O frasco é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

7. As duas placas de petri e o frasco cico contendo meio de agar de tributirina s esterilizados a 121 (press de 15 psi) durante 15 minutos numa autoclave.

8. Após a esterilização, eles são removidos da autoclave e deixados esfriar por algum tempo, sem permitir que o meio solidifique. O resfriamento do meio evita a condensação e o acúmulo de gotículas de água dentro das placas. Se o meio já tiver sido preparado e solidificado durante o armazenamento, ele deve ser liquefeito aquecendo cuidadosamente até que derreta completamente.

9. Para preparar placas de agar tributirínico, antes que o meio de agar tributirina esterilizado resfrie e solidifique, em condição fundida quente, ele é vertido assepticamente, preferivelmente dentro de uma câmara de fluxo laminar, para as duas placas de Petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada). o meio derretido cobre completamente o fundo das placas de petri.

Em seguida, as placas são cobertas com as tampas e deixadas esfriar, de modo a solidificar o meio dentro delas. A tributirina forma uma emulsão, quando dispensada em ágar, produzindo um meio opaco. O vapor de água que pode condensar na superfície interna das placas e tampas é evaporado, mantendo as placas e tampas em posição invertida em uma incubadora a 37 ° C por cerca de 1 hora.

10. Cada placa é marcada no lado inferior em quatro trimestres.

11. A “inoculação pontual” das bactérias de teste é feita assepticamente, preferencialmente dentro de uma câmara de fluxo laminar, no centro de cada quarto, fazendo uma mancha (ou pequeno esfregaço) das bactérias com a ajuda de um laço esterilizado por chama. O laço é esterilizado após cada inoculação.

12. As placas inoculadas são incubadas em posição invertida, de cima para baixo, a 37 ° C por 24 a 48 horas em uma incubadora até que as colônias das bactérias sejam visíveis.