Criopreservação de Gametas em Peixes
Neste artigo vamos discutir sobre a criopreservação de gametas em peixes.
A criopreservação é uma técnica de armazenamento com praticamente nenhum limite de tempo. Preservação de gametas de peixes foi tentada com esta técnica. A criopreservação de espermatozóides é um procedimento bem estabelecido na criação de animais.
Agora, os espermatozóides criopreservados são utilizados com sucesso na inseminação de bovinos, equinos, suínos, ovinos e criadores de aves. É interessante notar que grandes esforços foram feitos para transferir essa tecnologia para a preservação de espermatozóides, óvulos e embriões de peixes.
Essa técnica ajudará os criadores de peixes das seguintes maneiras:
(1) O problema da não coincidência de maturação de machos e fêmeas pode superar, se espermatozóides ou óvulos são mantidos em estoque.
(2) O programa de reprodução seletiva pode ser realizado para melhorar o estoque indígena e ajudar o terceiro mundo a criar suas espécies nativas e produzir linhagens especiais de talo superior.
(3) A técnica de criopreservação de gametas desempenhará um papel importante na conservação de germoplasma indígena, já que muitos peixes indígenas não podem competir com peixes exóticos. Por essa técnica, os gametas de espécies ameaçadas são depositados como uma proteção contra a variabilidade genética cada vez menor causada por distúrbios ambientais.
(4) Pode ajudar na produção de cultura mono-sexual.
(5) Se os gametas puderem ser preservados com sucesso, podemos desenvolver peixes ao longo do ano conforme nossa necessidade e podemos ajudar a estabelecer o banco genético para preservar a originalidade genética da população e mantê-los disponíveis para reintrodução quando as condições gerais de sobrevivência melhorarem.
Os espermatozóides, óvulos e embriões podem ser criopreservados, mas a preservação de ovos e embriões é difícil devido à indisponibilidade de crioprotetores para serem absorvidos suficientemente nestas células devido ao seu grande tamanho em comparação com os espermatozóides.
A criopreservação de espermatozóides em peixes é bem sucedida no homem; espécies Estas espécies são Oncorhynchus, Salmo, Salvilinus fontinalis, Hucho hucho, Thymallus thymallus, Esox lucius e Cyprinus carpio, Serothodon mossambicus; Labeo rohita, Catla catla e Cirrhinus mrigala.
Os seguintes passos devem ser seguidos na preservação dos espermatozóides:
(1) Recolha de milt (sémen).
(2) Preparação da solução extensora.
(3) Seleção de crioprotetor.
(4) Congelamento.
(5) Sucesso na fertilização.
Colecção de Milt:
O primeiro passo é coletar espermatozóides. Normalmente, os espermatozóides são coletados de peixes saudáveis pelo método de decapagem. O cateter pode ser usado, o que é uma alternativa melhor à decapagem. Os machos com melhor característica foram selecionados e lavados com solução de Ringer e a região das papilas genitais é seca.
A chocadeira pode ser anestesiada ou não anestesiada. A anestesia geralmente utilizada é de 0, 3 ml / l de fenoxietanol. Segundo Kumar (1989), uma injeção de suston 250 (organon) antes da decapagem dá melhor resultado em carpas indianos. A maioria dos trabalhadores neste campo recomendou peixes não anestesiados para desmatar para obter leite.
O milt é coletado em seringas ou tubos de hemólise e posteriormente preservado em ampolas de vidro (seladas ou não seladas), palhetas de plástico e muitas vezes em sacos plásticos. A cor, volume, densidade, pH e motilidade dos espermatozóides devem ser notados.
A amostra deve estar livre de matéria urinária e fecal. Um esfregaço da amostra deve ser examinado ao microscópio para detectar anormalidades nos espermatozóides. Se a amostra estiver OK, coloque para processamento adicional, caso contrário, amostras frescas de novos reprodutores podem ser coletadas.
Durante o período de coleta e preservação dos espermatozóides, a seringa / ampola / palha pode ser mantida na água da lagoa para manter a temperatura constante. Legendary e Billard (1980) coletaram espermatozóides em tubos de hemólise em gelo derretido e, em seguida, armazenaram em uma superfície refrigerada a 4 ° C.
A preparação e a seleção do extensor, uma solução na qual o milt é coletado, é mais importante para a criopreservação. O extensor previne o esgotamento da energia espermática e mantém os espermatozóides em condições precisas, mas vivos.
Existem dois extensores básicos. Eles são chamados Mounibs medium (M) e Menezo medium (Me). Nestes dois meios, a albumina sérica bovina (BSA) e a gema de ovo telurito são adicionados. Para os peixes indianos, vários extensores foram tentados modificando seus constituintes seguintes.
Os constituintes comuns são cloreto de sódio, KCl, CaCl2, NaHCO3, Na2HPO4 e MgSO4. Além destes, nutrientes e glicina também são adicionados para melhorar a criopreservação. Antibióticos como gentomicina ou estreptomicina também são adicionados à solução extensora, se necessário.
Crioprotetor:
A principal função do crioprotetor é penetrar na célula e ajudar os espermatozóides a tolerar a temperatura de congelamento. O mais importante e utilizado amplamente é o DSMO (dimetil sulfóxido) e o glicerol. Harvey (1983) usou metanol, DSMO e glicerol em combinação com leite em pó ou gema de ovo.
A solução crioprotetora e extensora em uma proporção fixa, geralmente uma parte do crioprotetor e nove partes da solução extensora é conhecida como diluente. Neste diluente, os espermatozóides são coletados para posterior processamento para congelamento.
O diluente (crioprotetor + diluente + espermatozóides) é coletado em palhas de polivinila e as duas extremidades das palhetas são seladas e agora estão prontas para congelamento ou resfriamento. O banho pode ser resfriado, a temperatura é mantida entre 0-5 o C. Durante o congelamento, o CO 2 e o nitrogênio líquido são utilizados. O armazenamento refrigerado de teleostomáceas (0-50 o C) tem sido estudado extensivamente em Salmonídeos.
No procedimento de congelamento, muitos problemas, como choque frio, formação de gelo intracelular e choque osmótico, devem ser controlados. A criopreservação geralmente significa armazenamento de células ou tecidos a -196 o C, a temperatura do nitrogênio líquido (Fig. 22.1).
A lesão celular deve ser controlada. Três tipos de lesão celular geralmente ocorrem. O primeiro é o choque frio, que é causado pelo resfriamento acima das temperaturas de congelamento. Isto é mais importante para os óvulos, não muito importante para os espermatozóides.
Isso ocorre até 0 ° C. Quando a temperatura vai de 0 ° C e -80 ° C, ocorre o choque osmótico e a formação de gelo intracelular em óvulos e espermatozóides. Para uma criopreservação bem-sucedida, essas coisas são controladas.
Em resumo, os canudos contendo o diluente são transferidos para canisters. Os recipientes contendo palhetas depois de permitir vários períodos de equilíbrio são mergulhados primeiro nos vapores de nitrogênio líquido e depois em nitrogênio líquido na temperatura de -196 ° C. Legendra e Billard (1980) armazenaram os espermatozóides de trutas arco-íris em gelo seco (CO 2 -79 ° C sólido) ou em nitrogênio líquido até 6 meses.
Em várias espécies de água doce, o congelamento foi realizado por meio da peletização de espermatozóides suspensos em gelo seco. A transição de 0 ° C a -70 ° C dura aproximadamente 2 minutos, resultando em uma taxa de 35 o C / min. Desde que a taxa diminui acima de - 60 ° C. Os melhores resultados são obtidos em nitrogênio líquido.
Descongelamento:
O descongelamento é um evento reverso de congelamento. O descongelamento é feito em banho-maria a temperaturas variando de 10 ° C a 60 ° C. O sucesso de todo o procedimento depende da motilidade dos espermatozóides e da capacidade de fertilizar óvulos.
Stoss e Holtz (1982) aumentaram a motilidade de espermatozóides de salmão rosa de 30 segundos a 10 minutos, ativando com uma solução de NaHCO3 de 120 nm, à qual foi adicionado 1 BMX (3-isobutil-1-metil xanthium). Kumar (1989) afirmou que o período de armazenamento é de cerca de 20 dias em L. rohita e H. molitrix sob condições criogênicas.
Os ovos de Salmo gairdeneri, Onchorhynchus kisutch e O.keta foram fixados removendo através do processo de decapagem e selados em sacos plásticos juntamente com o líquido celômico e mantidos sob oxigênio a 1 ° C. Os ovos são então espalhados para formar uma camada de um ou dois ovos de profundidade.
Os ovos, em seguida, misturados com solução diluente e crioprotetor quase da mesma forma como descrito anteriormente para os espermatozóides. De acordo com Harvey e Kelley (1984), o armazenamento não congelado (refrigerado) de óvulos foi moderadamente bem sucedido em salmonídeos, com tempos de armazenamento em ordem de algumas semanas obtidos através da refrigeração de ovos oxigenados em fluido celômico.
