Transferência Genética Mediada por Agrobacterium em Plantas | Biotecnologia (com diagrama)
Transferência de genes mediada por Agrobacterium em plantas!
Agrobacterium é uma bactéria patogênica gram-negativa envolvida em causar doença de formação de galhas de copa em espécies de plantas. A formação de galhas na copa é devida à transferência de um segmento de DNA oncogênico (causador de câncer) para a célula da planta em locais feridos.
Este segmento de DNA (DNA de transferência ou T-DNA) está presente em um grande plasmídeo chamado plasmídeos indutores de tumor (Ti) na bactéria. O T-DNA (com cerca de 20 kb de comprimento) é integrado no cromossomo da planta por recombinação. Uma série de virulência (vir) genes estão envolvidos no direcionamento do processo de infecção. Então, quando a raiz de uma planta ou um caule é ferido, ela libera certa resposta.
Em resposta a esses sinais, os genes vir de A. tumefactions tornam-se ativados e direcionam uma série de eventos necessários para a transferência do T-DNA do plasmídeo Ti para o cromossomo da planta. A função de diferentes genes vir incluem uma cópia do T-DNA, seguida pela ligação de um produto à fita de T-DNA copiada para atuar como líder, e subsequentemente adicionar proteínas junto com o comprimento do T-DNA, possivelmente como um protetor mecanismo.
Estes eventualmente abrem um canal na membrana celular bacteriana, através do qual o T-DNA passa. O T-DNA então entra na planta através da ferida. No entanto, ainda não está claro como o DNA bacteriano se move do citoplasma para o núcleo da célula da planta, ou como o T-DNA se integra nos cromossomos da planta.
Para usar essas bactérias como um vetor, sua região de T-DNA é removida, exceto as regiões de fronteira e os genes vir. O transgene é então inserido entre as regiões do T-DNA, onde é transferido para a célula vegetal e se integra ao cromossomo da planta (Fig. 1). O T-DNA é clonado em plasmídeos de Ti, que são cortados em tamanho e replicados em E. coli para facilitar a manipulação adicional. Estes vetores são mobilizados em cepas hospedeiras de Agrobacterium e usados para infectar os tecidos vegetais.
Estes tecidos vegetais infectados são subsequentemente cultivados em meios contendo produtos químicos específicos, reguladores de crescimento para facilitar a regeneração de células transformadas. A seleção de trans-formantes é feita na presença de um antibiótico presente no meio de cultura. As plantas transformadas são eventualmente analisadas quanto a integração estável e análise funcional do gene inserido.
Fusão Protoplast:
As células sem a parede celular são referidas como protoplastos. Esses protoplastos podem absorver o DNA diretamente na presença de certos produtos químicos (como polietilenoglicol, PEG). Maior concentração de PEG causa permeabilização da membrana plasmática, o que permite a captação de DNA em protoplastos. Até mesmo sinais elétricos podem ser usados para criar pequenos orifícios na membrana plasmática passando uma corrente elétrica.
Isso é conhecido como eletroporação. Essas pequenas aberturas ajudam na captação de DNA estranho por protoplastos. Isto é subsequentemente seguido pela formação da parede celular e início da divisão celular. No entanto, a produção de plantas transgênicas por transferência direta de genes para protoplastos depende de um sistema eficiente de protoplasto para regeneração de plantas.
Gene-gun ou Transferência Genética Biolística:
Essa é a técnica mais recente em que se pode entregar DNA de interesse em uma célula carregando micro partículas (como ouro ou tungstênio) em alta velocidade. Esse processo de entrega de DNA é chamado de bombardeio. Dentro da célula, as moléculas de DNA são liberadas das partículas e, eventualmente, esse DNA é integrado ao genoma nuclear ou organela da célula hospedeira.
As ex-plantas teciduais são eventualmente cultivadas em meios contendo hormônios específicos / antibióticos para selecionar as plantas transformadas. Uma vez que o gene de interesse é transferido para o hospedeiro desejado, sua integração estável precisa ser estabelecida, o que é feito regenerando as plantas. Isto é conseguido pela técnica de cultura de tecidos.
O processo de cultura de tecidos pode ser dividido em quatro etapas:
Estágio I:
Inclui a seleção dos explantes adequados e sua transferência para meio nutriente.
Estágio II:
Inclui a proliferação de tecido crescente no meio de multiplicação.
Estágio III:
Inclui a transferência de tecido crescente (calo) para a mídia, onde ele pode se diferenciar em suas várias partes.
Estágio IV:
Inclui transferência de mudas para o ambiente natural. No entanto, os genes de interesse podem ser adicionados de duas maneiras como orientação de sentido e anti-sentido. Para expressar ou exprimir o gene, pode-se colocar o gene na orientação dos sentidos. No entanto, se alguém quiser bloquear o produto indesejável ou um passo em uma via bioquímica, pode-se colocar o gene em uma orientação anti-sentido.