Coloração de Esporos de Bactérias para Diferenciar Esporos Bacterianos e Células Vegetativas

Objetivo:

Todas as bactérias permanecem em suas "formas vegetativas", se as condições ambientais forem favoráveis para suas atividades metabólicas normais.

Nesta forma, eles absorvem nutrientes, crescem e se reproduzem.

Por outro lado, a maioria deles morre, quando as condições ambientais se tornam adversas, como frio intenso, calor extremo, envelhecimento, falta de nutrientes, exposição à radiação e produtos químicos tóxicos.

No entanto, poucas espécies de bactérias podem sobreviver sob tais condições adversas, mudando-se para formas altamente resistentes, metabolicamente inativas, chamadas "esporos". Em condições adversas, um esporo é produzido dentro de uma célula vegetativa por desidratação e contração do seu conteúdo celular.

Esse esporo, formado dentro da célula bacteriana, é chamado de 'endosporo' (Figura 2.13). Se as condições adversas piorarem, a célula se rompe, liberando o endosporo, que agora se torna uma célula dormente independente chamada "esporo".

O processo de formação de esporos é chamado de "esporogênese". O esporo tem camadas espessas e relativamente impermeáveis, como o córtex dos esporos e o revestimento de esporos, que protegem a célula de qualquer dano físico. O esporo ganha sua resistência por vários mecanismos, que ainda não foram claramente explicados.

Quando as condições se tornam favoráveis, as camadas que cobrem a ruptura do esporo e o esporo dão origem a uma célula vegetativa metabolicamente ativa. Esse processo é chamado de "germinação".

Assim, com base na capacidade de formar esporos, as bactérias podem ser divididas em dois grupos como se segue:

(1) Bactérias formadoras de esporos (formadores de esporos):

Uma bactéria, que pode produzir um esporo para sobreviver sob condições ambientais adversas, é uma bactéria formadora de esporos (formadora de esporos). Principalmente, os seguintes três gêneros de bactérias em forma de bastonete podem produzir esporos sob condições ambientais adversas.

A. Bactérias aeróbicas em forma de bastão

1. Bacillus spp.

B. Bactérias anaeróbias em forma de bastonete

2. Clostridium spp.

3. Desulfotomaculum spp.

(2) Bactérias não formadoras de esporos (não formadoras de esporos):

Uma bactéria, que não pode produzir um esporo e, portanto, morre em sua forma vegetativa sob condições ambientais adversas, é uma bactéria não formadora de esporos (não formadora de esporos).

O objetivo da coloração de esporos é diferenciar os esporos e células vegetativas de um formador de esporos e diferenciar os formadores de esporos dos não-formadores de esporos. A coloração de esporos também é útil na identificação das bactérias pertencentes aos gêneros Bacillus, Clostridium e Desulfotomaculum.

Princípio:

Os esporos são diferentes das células vegetativas porque possuem camadas espessas e relativamente impermeáveis ao seu redor (Figura 2.14). A mancha primária, verde malaquita, não pode penetrar nos esporos através dessas camadas.

Portanto, a penetração da mancha primária é aumentada pela aplicação de calor, que a conduz através das camadas de cobertura para o protoplasto de esporos. Agora, os esporos parecem verdes. Quando os esporos são tratados com o agente de descoloração, água da torneira, eles não sofrem descoloração, pois excluem a água.

A água da torneira remove apenas o excesso de mancha primária presente no entorno dos esporos. Assim, os esporos retêm a cor verde. Subsequentemente, quando contra-coradas com safranina, as moléculas de safranina não podem entrar nos esporos através das camadas de cobertura. Assim, finalmente, os esporos retêm a cor verde da mancha primária e aparecem em verde.

Por outro lado, as células de bactérias vegetativas absorvem facilmente a coloração primária, verde de malaquita, mas a mancha não tem forte afinidade pelos componentes celulares vegetativos, devido à qual ela é lavada, quando descorada sob água da torneira.

Agora, as células vegetativas parecem incolores. Quando contra-coradas com safranina, as células vegetativas incolores absorvem a mancha e aparecem em vermelho, ao contrário dos esporos, que parecem verdes.

Materiais requisitados:

Slide, loop, verde malaquita, safranina, bactérias formadoras de esporos, placa quente, microscópio, óleo de imersão.

Procedimento:

1. Um escorregador é limpo adequadamente sob água da torneira, de modo que a água não permaneça como gotas em sua superfície.

2. A água aderente é eliminada com papel absorvente e a lâmina é seca ao ar.

3. Um esfregaço de bactérias formadoras de esporos é feito no centro de uma lâmina em dois métodos, conforme indicado abaixo.

(uma) Se o crescimento de esporos em placa de ágar ou agar inclinado for observado, uma gota de água é colocada no centro da lâmina. Uma alça é esterilizada sobre a chama e uma alça de Clostridium de bactérias de uma placa envelhecida ou cultura inclinada (48-72 horas de idade) do formador de esporos, tais como supergenes de Clostridium ou Bacillus subtilis é transferida para a gota de água.

Então, pela rotação suave do laço na gota de água, é feita uma suspensão de bactérias e a gota é espalhada até que uma mancha seja obtida. À medida que aumenta a idade das bactérias formadoras de esporos em culturas de placa ou inclinação, elas formam esporos.

b) Se for observado crescimento de esporos em caldo líquido, a cultura de caldo, contendo apenas células vegetativas, é submetida a estresse térmico, por aquecimento em banho-maria por 15 minutos, de modo que algumas das células vegetativas formem esporos para superar o estresse por calor. Uma gota da suspensão mista de células vegetativas de esporos da cultura de caldo é colocada diretamente no centro da lâmina por um laço estéril e um esfregaço é feito por espalhamento.

4. O esfregaço é seco ao ar.

5. O esfregaço é fixado por aquecimento. O aquecimento resulta na coagulação das proteínas celulares, devido às quais as células aderem à superfície da lâmina e não são lavadas durante a coloração. A fixação de calor é feita passando rapidamente a lâmina acima de uma chama 2-3 vezes, com o esfregaço superfície voltada para cima, de modo que o esfregaço não fique aquecido.

6. O esfregaço é inundado com a mancha primária, verde malaquita.

7. A lâmina é mantida em uma chapa quente e a preparação deixada a vapor por 2-3 minutos. A temperatura da placa quente é ajustada de tal forma que a preparação não ferve e evapora rapidamente. A perda de evaporação é reabastecida, para que o esfregaço não seque.

8. O slide é removido da placa quente e resfriado.

9. O esfregaço é descolorido lavando-se com água corrente levemente escoada, de tal forma que a água não caia diretamente no esfregaço.

10. O esfregaço é inundado com a contra-mancha, safranina, por 30 segundos.

11. O excesso de mancha de contraste é completamente lavado do esfregaço sob água da torneira de fluxo suave, de tal forma que a água não caia diretamente no esfregaço.

12. A lâmina é seca com papel absorvente.

13. A lâmina é presa ao estágio do microscópio e o esfregaço é observado sob baixa potência e altos objetivos secos.

14. Uma gota de óleo de imersão é colocada no esfregaço.

15. O esfregaço é observado sob o objetivo de imersão em óleo.