Avanços Recentes no Diagnóstico da Malária

Avanços Recentes no Diagnóstico da Malária - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Introdução:

Na Índia, a malária é um grande problema de saúde; tem havido freqüentes surtos em Rajasthan e no nordeste do país. Na incidência do Rajastão, P. falciparum está aumentando. Em Delhi, P. vivax é a espécie mais comum, mas o P. falciparum também é encontrado. A malária, um problema mundial, mata entre 1, 5 a 2, 7 milhões de pessoas a cada ano. Em outras palavras, mata uma pessoa (geralmente uma criança <5 anos) a cada 12 segundos. Além disso, 300 a 500 milhões de pessoas estão infectadas com a doença a cada ano.

Para o controle da doença, o diagnóstico rápido e preciso é o mais importante. O diagnóstico da malária é muitas vezes feito apenas com base em sintomas clínicos, embora sua precisão seja de, no máximo, 50%. Novas técnicas avançadas de diagnóstico estão agora disponíveis. Investigações recentemente introduzidas baseadas em imunoensaio são rápidas (<10 min / teste) e pelo menos tão sensíveis como a microscopia tradicional.

Microscopia de Luz: Manchas de sangue espesso e fino:

O procedimento laboratorial tradicionalmente aceito para o diagnóstico da malária tem sido o exame microscópico de esfregaços sanguíneos corados com Giemsa ou Field. Idealmente, o sangue deve ser obtido por uma picada no dedo; no entanto, o sangue obtido por punção venosa e anticoagulado (EDTA ou heparina) é aceitável se examinado imediatamente. Manchas grossas e finas devem ser feitas. Esfregaço espesso, concentra os eritrócitos 20 - 30 vezes em uma pequena superfície, aumenta a sensibilidade da técnica e é muito melhor do que esfregaços finos. O esfregaço fino, no entanto, é mais específico.

É o padrão ouro aceito para o diagnóstico, mas é trabalhoso e a interpretação dos resultados requer considerável conhecimento, particularmente com baixa parasitemia. Além disso, os parasitas do P. falciparum, muitas vezes isolados do sangue periférico, podem ser facilmente perdidos.

Quantificação de Parasitas por Exame de Esfregaços de Sangue:

Existem muitos métodos para quantificar os parasitas da malária em esfregaços espessos. Os níveis de parasitas também podem ser quantificados pelo exame de um esfregaço de sangue fino. Uma grande desvantagem dos esfregaços espessos é que, muitas vezes, requer um certo grau de especialização que pode não estar disponível.

Teoricamente, o examinador deve contar os campos de esfregaços espessos contendo 20 ou mais leucócitos / hpf. Na realidade, os campos contendo 20 ou mais leucócitos são muito espessos para serem contados, enquanto os campos mais fáceis de ler são aqueles que contêm apenas cinco ou seis leucócitos / hpf.

Antes da coloração, o examinador deve ser capaz de ler a impressão através de um esfregaço de sangue denso e bem preparado. O exame de esfregaços finos é apenas um décimo tão sensível quanto o exame de esfregaços espessos. Assim, embora o exame de esfregaços de sangue seja aceitável como o "padrão ouro" universal, não há, na verdade, um método padrão único, usado por todos os pesquisadores, para a quantificação de parasitas pela contagem de parasitas em esfregaços espessos.

Além disso, sob pessoal treinado, a falta de microscópios limita a utilidade do exame de esfregaço de sangue em muitas áreas endêmicas. Reconhecendo estas limitações, foram desenvolvidas técnicas alternativas para o diagnóstico da malária.

Microscopia Fluorescente:

Três técnicas fluorescentes são promissoras para o diagnóstico da malária.

Esses são:

i) O método quantitativo da camada leucoplaquetária (OBC) disponível como kit comercial

ii) O processo Kawamoto Acridine Orange (AO) e

(iii) Procedimento de benzotiocarboxipurina (BCP).

Estas três técnicas são rápidas e fáceis de executar; quando há mais de 100 parasitas / µL, eles demonstram sensibilidade e especificidade equivalentes àquelas obtidas pelo exame de esfregaço espesso.

Os métodos de OBC e Kawamoto usam laranja de acridina (AO) como fluorocromo para corar os ácidos nucléicos dos parasitas da malária em uma amostra. BCP é também um fluorocromo, que mancha ácidos nucléicos. A OA é inespecífica e mancha os ácidos nucléicos de todos os tipos de células.

Consequentemente, o examinador precisa aprender a distinguir parasitas corados por fluorescência de outras células e detritos celulares. A sensibilidade da coloração AO com níveis de parasitas inferiores a 100 parasitas / µl foi de 41, 7-93 por cento.

A especificidade da coloração de AP para P. vivax e P. falciparum é de 52 e 93 por cento, respectivamente. O método BCP tem uma sensibilidade e especificidade de mais de 90%. Limitação importante de métodos baseados em AO e BCP é a sua incapacidade de diferenciar entre espécies de Plasmodium. AO é perigoso e requer requisitos especiais de descarte.

O OBC e o BCP são mais exigentes tecnicamente que o Kawamoto. Os métodos Kawamoto e AO requerem equipamento e suprimentos especiais e são mais caros. O preço de um microscópio de fluorescência pode ser um fator limitante para laboratórios interessados ​​em utilizar esses métodos.

Detectando seqüências específicas de ácidos nucléicos:

A detecção de sequências de ácidos nucleicos específicas para parasitas de Plasmodium pode ser útil. Em técnicas baseadas em PCR, a sequência alvo amplificada é detectada por sondas internas ou analisada por electroforese em gel. A principal vantagem de usar uma técnica baseada em PCR é a capacidade de detectar uma baixa parasitemia. Infecções com parasitas vivos podem ser detectadas com 100 por cento de especificidade.

No entanto, tais técnicas são dispendiosas e exigem muito trabalho, requerem perícia técnica extensa, envolvem múltiplos passos e não podem ser usadas para distinguir entre organismos viáveis ​​e não viáveis.

Os inibidores de PCR naturalmente presentes em amostras de sangue podem resultar em um número significativo de resultados falso-negativos. Resultados falso-positivos, devido à contaminação por transmissão, também foram registrados.

Técnicas baseadas em PCR têm sido usadas para selecionar doadores em uma área onde a malária é endêmica. A sensibilidade e a especificidade dos métodos baseados em PCR, estimados pelo exame de esfregaços de sangue como o “padrão ouro”, são de 90% ou mais.

Além disso, novos avanços na tecnologia de PCR podem em breve permitir que parasitas viáveis ​​sejam diferenciados de não viáveis. Actualmente, a utilidade de tal tecnologia é limitada pela necessidade de equipamento de laboratório dispendioso e especializado, pessoal treinado em tecnologias genéticas e instalações de 'sala limpa' e por um elevado custo de enzimas e iniciadores utilizados.

Detecção do antígeno:

Testes de detecção de anticorpos para malária foram limitados em sensibilidade e sua capacidade de distinguir infecções ativas de anteriores. A nova geração de testes de captura de antígenos é capaz de detectar menos parasitas e produzir resultados rápidos (10 a 15 min). Eles são kits comercialmente disponíveis, que incluem todos os reagentes necessários e não requerem treinamento ou equipamento extensivo.

Existem dois antígenos parasitários usados ​​nos novos testes rápidos de diagnóstico, a proteína 2 rica em histidina (HRP-2), que é produzida apenas pelo P. falciparum e pelo antígeno parasita lactato-desidrogenase (pLDH), produzido pelos quatro espécies de plasmodium que infectam o homem. Ambos os antígenos são secretados no sangue por todos os estágios assexuais do parasita; o antígeno pLDH também é produzido por gametócitos.

Os mais recentes testes de captura de antígenos são rápidos e simples de realizar e têm limites de detecção comparáveis ​​aos de microscopia de alta qualidade (ou seja, 100 a 200 parasitas / µL) .Quando há mais de 60-100 parasitas / µL, o HRP- Os testes baseados em 2 são altamente (> 90%) sensíveis e (> 90%) específicos, quando comparados com a baciloscopia de espessura.

Atualmente, dois desses testes estão comercialmente disponíveis, o teste ParaSight F e o Teste de Malária Pf para imunocromatografia (ICT). Ambos os testes são realizados em amostras de picada no dedo e detectam apenas malária por P. falciparum.

Eles são baseados em anticorpos monoclonais para HRP-2, que são imobilizados em tiras de nitrocelulose, para produzir testes de imersão ou papelão (ICT Pf Test). Em cada teste, um resultado positivo é indicado pelo aparecimento de uma linha vermelha na tira de teste, onde os anticorpos monoclonais são imobilizados.

Ambos os testes também contêm um controle interno; uma linha de controle deve aparecer para que um teste seja considerado válido. Sensibilidade e especificidade do teste ParaSight F são 88 e 97 por cento, respectivamente, comparáveis ​​com PCR.

Embora os testes sorológicos baseados em HRP-2 tenham permitido o diagnóstico rápido da malária falciparum, eles têm utilidade limitada. Como a HRP-2 está presente apenas no P. falciparum, os testes baseados na detecção da HRP-2 são negativos com infecção causada por vivax, ovale ou malária.

Muitos casos de malária não-falciparum serão, portanto, mal diagnosticados como negativos para a malária. Outra limitação dos testes baseados em HRP-2 é que o HRP-2 persiste no sangue muito tempo depois que os sintomas clínicos desapareceram e os parasitas aparentemente desapareceram do hospedeiro.

De fato, o HRP-2 foi descoberto em múmias. Os testes para este antígeno podem, portanto, não ser úteis para o rastreamento de pessoas indígenas em áreas endêmicas, que podem ter parasitemia persistente e de baixo nível. A possível razão para a persistência do antígeno HRP-2 não é bem compreendida; pode refletir a presença de parasitas latentes e viáveis ​​(possivelmente um resultado de falha do tratamento) ou de complexos antígeno-anticorpo solúveis.

A persistência também pode depender do tipo de terapia anti-malária instituída. O sinal de HRP-2 pode persistir por 19 dias após terapia aparentemente eficaz com quinina e doxiciclina. Também foi observada antigenemia HRP-2 persistente durante e após a terapia com artemeter.

Outras limitações estão especificamente relacionadas aos aspectos técnicos do sistema HRP-2. Por exemplo, a IgG monoclonal utilizada no sistema ParaSight F pode reagir de forma cruzada com o fator reumatóide e causar uma resposta positiva falsa.

O teste ICT Pf utiliza uma IgM monoclonal, que não apresenta reação cruzada e não há relatos de reações falso-positivas ocorrendo com este teste devido ao fator reumatóide. O teste ICT Pf, no entanto, requer armazenamento a 4 ° C, o que limita sua utilidade em situações de campo.

Ensaios Serológicos baseados em pLDH:

Os mais recentes testes serológicos rápidos para o diagnóstico da malária baseiam-se na detecção de pLDH. Tal como os ensaios baseados em HRP-2, estes testes são sensíveis, específicos e fáceis de executar, com resultados obtidos em menos de 15 minutos.

Os ensaios baseados em pLDH também são capazes de diferenciar entre P. falciparum e outras espécies de Plasmodium e, como o pLDH é produzido apenas por parasitas viáveis, eles também são úteis no monitoramento da terapia anti-malária. O pLDH de P. falciparum é diferenciado da LDH hospedeira (h-LDH) com 3-acetilpiridina adenina dinucleotídeo (APAD), um análogo do Dinucleotídeo de Nicotinamida Adenina (NAD).

Os ensaios baseados em pLDH estão disponíveis em duas formas, uma vareta semiquantitativa e seca (OptiMAL); e um ensaio quantitativo de captura imuno-enzimica. O ensaio OptiMAL utiliza dois anticorpos monoclonais, um específico para o P. falciparum e o outro para todos os 4 Plasmodia.

A amostra de sangue testada (10 µl de picada no dedo, sangue total ou hemolisado congelado) é misturada com 3 µg de tampão de lise contendo anticorpo monoclonal conjugado. Esta mistura é permitida para mergulhar no OptiMAL, vareta.

Após 3 min, 100 µL de tampão de limpeza são adicionados. Se P. falciparum estiver presente na amostra de sangue, três linhas (incluindo uma, no topo de cada palito, representando o controle positivo) se desenvolvem em varetas.

Duas linhas indicam P. vivax, P. malariae ou ocasionalmente P. ovale. Uma tira OptiMAL-2 recém-formatada tem três linhas de teste e uma linha de controle positiva, o que permite que todas as quatro espécies de Plasmodium sejam identificadas.

Cada teste é considerado apenas inválido se a linha de controle for desenvolvida. Os anticorpos monoclonais utilizados no teste OptiMAL foram exaustivamente testados para reatividade cruzada com LDH de leishmania, babesia e bactérias ou fungos patogênicos e nenhuma evidência de tal reatividade cruzada foi encontrada.

Verificou-se que a HRP-2 persistia bem após a parasitemia periférica ter desaparecido. Embora os níveis de pLDH acompanhem de perto a parasitemia periférica e caiam para valores indetectáveis ​​3-5 dias após a terapia com quinina e doxiciclina, os níveis de antígeno HRP-2 caíram apenas após 19 dias, bem após o paciente ser sintoma e aparentemente livre de parasitas.

O ensaio OptiMAL deve, portanto, ser uma ferramenta valiosa no monitoramento da terapia anti-malária. A depuração da parasitemia e a depuração do pLDH parecem ser paralelas entre si.

Os ensaios OptiMAL são muito versáteis. O teste OptiMAL, tem sensibilidades de 94-88 por cento respectivamente e especificidade de 100 e 99 por cento para P. vivax e P. falciparum, respectivamente, quando comparado com esfregaços de sangue.

Este teste pode ser usado como uma ferramenta epidemiológica, pois, em áreas onde mais de uma espécie de Plasmodium está circulando, ele pode ser usado para identificar rapidamente as espécies de Plasmodium que infectam pacientes em cada aldeia e permitir que profissionais de saúde pública forneçam a quimioterapia mais apropriada. .

Conclusões

Nos últimos anos, os esforços para substituir a leitura tradicional e tediosa de esfregaços de sangue (método desenvolvido há quase 100 anos) levaram a técnicas para a detecção de parasitas da malária que produzem sensibilidades equivalentes ou melhores que a microscopia.

Embora os métodos baseados em PCR sejam indiscutivelmente os mais sensíveis, eles são tão caros e precisam de equipamentos e treinamento tão especializado que é improvável que sejam usados ​​para diagnóstico de rotina na maioria dos países em desenvolvimento.

Eles são particularmente úteis para estudos sobre diferenças de linhagens, mutações e genes envolvidos na resistência a drogas no parasita, e para mostrar o nível de parentesco entre cepas associadas a diferentes surtos de malária. Os novos diagnósticos de malária mais promissores são os testes sorológicos com fita reagente.

Esses testes, incluindo o ParaSight F, o ICT Pf Test e o OptiMAL, são simples de usar, fáceis de interpretar e produzem resultados em 15 minutos ou menos. Esses testes são quase tão sensíveis quanto o exame microscópico de esfregaços de sangue, mas não requerem pessoal altamente qualificado para executar ou interpretar os resultados.

O teste OptiMAL, tem as vantagens de ser capaz de detectar todas as quatro espécies de Plaspiodium e de acompanhar a eficácia da terapia medicamentosa, uma vez que mede uma enzima produzida apenas por parasitas vivos.

Embora os testes com a vareta apresentem duas limitações óbvias, nenhum deles deve impedir que esses testes recebam ampla aceitação. A primeira limitação é a da sensibilidade. Os três ensaios atualmente comercializados têm limiares de sensibilidade de 50-100 parasitas / µ1. A sensibilidade para amostras com <50 parasitas / µL é consistentemente de 50% -70%.

Este nível de sensibilidade pode não ser um grande problema para aqueles que vivem permanentemente em áreas endêmicas, que freqüentemente não recebem tratamento a menos que tenham mais de 500 parasitas / µL de sangue, mas podem representar um problema no diagnóstico de malária naqueles indivíduos. são de áreas não endêmicas, mas estão vivendo, trabalhando ou viajando em área endêmica.

No entanto, como a grande maioria dos pacientes com malária tem níveis de parasitas bem acima de 50 parasitas / µL, poucos pacientes seriam diagnosticados erroneamente se os testes com fita reagente fossem usados ​​rotineiramente. A segunda limitação de tais testes, pelo menos atualmente, é seu custo.

A Organização Mundial de Saúde considera que, para aqueles em áreas endêmicas para tirar proveito deles, os testes de diagnóstico para malária devem custar menos de US $ 0, 40 / amostra. A menos que os testes com a vareta sejam produzidos em grande número, esse preço é inatingível e não é prático para os fabricantes atenderem.

Os custos atuais dos testes de dipstick dependem da localização do comprador e do volume pedido. Por exemplo, os custos dos testes ICT Pf variam de US $ 1, 30 / teste em países em desenvolvimento. O teste Para 0Sight F é vendido por US $ 1, 20 / teste. Atualmente, a faixa optiMAL é vendida por US $ 3, 00 / teste.