Teste de oxidase em bactérias para descobrir sua capacidade de oxidar o citocromo C reduzido

Leia este artigo para aprender sobre o teste da oxidase em bactérias para descobrir sua capacidade de oxidar o citocromo C reduzido:

Princípio:

Algumas bactérias têm a capacidade de oxidase 'reduzida citocromo C' presente em suas células para 'oxidado citocromo C', como eles podem produzir a enzima 'citocromo oxidase'.

O citocromo oxidado C produz uma cor púrpura (roxo de Wurster) com o corante N-tetrametil-para-fenilenodiamina (isto é, reagente oxidase).

No teste da oxidase, placas de ágar nutriente contendo as colônias das bactérias de teste são inundadas com a solução de reagente oxidase. Se as bactérias têm a capacidade de produzir a enzima citocromo oxidase, a cor das colônias nas placas muda para roxo. Se as bactérias não têm a capacidade de produzir citocromo oxidase, as colônias mantêm a cor rosa original do reagente oxidase.

Materiais requisitados:

Placas de Petri, frasco cônico, tampões de algodão, alça de inoculação de fio de platina, autoclave, bico de bunsen, câmara de fluxo laminar, jarra de descarte, incubadora, tira de papel filtro Whatman, reagente oxidase (N-tetrametil-para-fenilenodiamina) nutriente, colônias isoladas culturas puras de bactérias.

Procedimento:

a) Método da placa:

1. Duas placas de petri são limpas, cobertas com papel craft e amarradas com fio ou elástico (Figura 7.19). Estes passos, bem como a esterilização das placas de petri no passo 6 são omitidos, se as placas de petri esterilizadas no forno forem utilizadas directamente.

2. Os ingredientes do meio nutriente ágar ou do seu pó pronto a usar, necessários para 100 ml de meio, são pesados e dissolvidos em 100 ml de água destilada, num balão cónico de 250 ml, agitando e agitando.

3. Seu pH é determinado usando um papel de pH ou medidor de pH e ajustado para 7, 0 usando 0, 1 N HCI se é mais ou usando 0, 1N NaOH se for menor.

4. O balão é aquecido para dissolver o ágar no meio completamente.

5. O frasco é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

6. As duas placas de petri e o frasco cônico contendo meio nutriente ágar são esterilizados a 121 ° C (15 psi de pressão) por 15 minutos em autoclave.

7. Após a esterilização, eles são removidos da autoclave e deixados esfriar por algum tempo, sem permitir que o meio solidifique. O resfriamento do meio evita a condensação e o acúmulo de gotículas de água dentro das placas. Se o meio já tiver sido preparado e solidificado durante o armazenamento, ele deve ser liquefeito aquecendo cuidadosamente até que derreta completamente.

8. Para preparar as placas de ágar nutriente, antes que o meio nutriente esterilizado resfrie e solidifique, em estado quente fundido, despeje assepticamente, de preferência dentro de uma câmara de fluxo laminar, nas duas placas de petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada), para que o meio derretido cobre completamente o fundo das placas de petri.

Em seguida, as placas são cobertas com as tampas e deixadas esfriar, de modo a solidificar o meio dentro delas. O vapor de água que pode condensar na superfície interna das placas e tampas é evaporado, mantendo as placas e tampas em posição invertida em uma incubadora a 37 ° C por cerca de 1 hora.

9. Cada placa é marcada no lado inferior em quatro trimestres.

10. A “inoculação pontual” das bactérias de teste é feita assepticamente, preferencialmente em uma câmara de fluxo laminar, no centro de cada quarto fazendo uma mancha (ou pequeno esfregaço) da bactéria com a ajuda de um laço esterilizado por chama. O laço é esterilizado após cada inoculação.

11. As placas inoculadas são incubadas em posição invertida, de cima para baixo, a 37 ° C por 24 horas em uma incubadora até que as colônias das bactérias sejam visíveis.

12. As placas são inundadas com reagente oxidase.

b) Método do papel:

1. Uma tira de papel de filtro Whatman, mergulhada em reagente oxidase a 1%, é seca e mantida no escuro.

2. Antes do uso, ele é umedecido e um loop das bactérias de teste é colocado como um ponto com a ajuda de um loop de fio de platina. O loop de nicromo pode oxidar o reagente. Portanto, o laço de platina deve ser usado.

3. O ponto é observado após 10 segundos.