Experiência para Cultivar e Enumerar um Bacteriófago
Experimente Cultivar e Enumerar um Bacteriófago!
Princípio:
Uma suspensão de bactérias, suscetíveis a um bacteriófago (vírus que infecta bactérias) é semeada com esse bacteriófago e deixada crescer como um gramado confluente em uma placa de ágar.
As partículas de bacteriófagos crescem dentro das células bacterianas e lisam-nas. A lise das células bacterianas resulta na formação de zonas claras no gramado confluente das bactérias. Essas zonas claras são chamadas de "placas". Cada zona clara é assumida como sendo formada por uma única partícula de bacteriófago. Assim, o número de unidades formadoras de placa (PFUs) representa o número do bacteriófago.
A técnica de diluição em série é utilizada na enumeração de bacteriófagos semelhantes aos utilizados na enumeração de bactérias. O número de partículas de fago contidas numa amostra é determinado pela contagem do número de placas formadas na placa de ágar semeada e multiplicando-a pelo factor de diluição.
Para determinar uma contagem de fagos válida, o número de placas por placa não deve exceder 300 nem ser inferior a 30. As placas que mostram mais de 300 PFUs são denominadas 'numerosas demais para contar' (TNTC), enquanto as placas com menos de 30 PFUs são denominadas "muito poucos para contar" (TFTC).
Materiais requisitados:
Caldo triptona, agar mole triptona, agar duro triptona, frasco cónico, tubos de ensaio, placas de petri esterilizadas, tampões de algodão, cultura em stock do bacteriófago (coliófago Ex: T2), caldo nutriente da bactéria (Ex: Escherichia coli B), pipetas esterilizadas, autoclave, banho de água quente, bico de bunsen, câmara de fluxo laminar, jarra de descarte, incubadora.
Procedimento:
1. Quinze pipetas (em uma caixa de pipetas de aço inoxidável) e cinco placas de Petri são esterilizadas em um forno de ar quente a 180 ° C por 3 horas. Alternativamente, eles podem ser cobertos com papel craft, amarrados com fio ou elástico e esterilizados em autoclave junto com o meio (Figura 8.3).
2. Os ingredientes do meio de caldo triptona ou do seu pó pronto a servir, necessários a 100 ml do caldo, são pesados e dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml, agitando e agitando. O seu pH é ajustado para 7, 5 usando HCl 0, 1 N ou NaOH 0, 1 N conforme requerido. O frasco é aquecido, se necessário, para dissolver completamente os ingredientes.
3. O caldo é distribuído em 10 tubos de ensaio (9 ml cada), revestidos de algodão, cobertos com papel craft e amarrados com fio ou elástico.
4. Os ingredientes do meio agar macio triptona ou do seu pó pronto a armazenar, necessário para 100 ml de meio, são pesados e dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml, agitando e agitando. O seu pH é ajustado para 7, 5 usando HCl 0, 1 N ou NaOH 0, 1 N conforme requerido. O frasco é aquecido para dissolver completamente o ágar no meio.
5. Este meio líquido é distribuído em 5 tubos de ensaio (2 ml cada), tapado de algodão, coberto com papel craft e amarrado com fio ou elástico.
6. Os ingredientes do meio agar duro com triptona ou o seu pó pronto para perfazer 100 ml do meio são pesados e dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml por aquecimento após ajuste do pH a 7, 5ºC. O frasco é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.
7. Os 10 tubos de caldo de triptona, os 5 tubos de agar mole de triptona e o frasco contendo meio de agar duro de triptona s esterilizados a 121 (press de 15 psi) durante 15 minutos numa autoclave.
8. O meio de agar duro de triptona esterilizado no frasco cico vertido para 5 placas de Petri esterilizadas de modo assico para obter 5 placas de agar duro com triptona.
9. Um ml da cultura-mãe do bacteriófago (coliófago Ex: T2) é transferido assepticamente, de preferência numa câmara de fluxo laminar, para um tubo de caldo de triptona (9 ml) utilizando uma pipeta esterilizada. Isso se torna a diluição de 10 vezes (ou seja, 10 -1 ). Este é assepticamente diluído em série nos outros nove tubos de caldo, de modo a obter uma diluição final de 10-10 (Figura 8.4).
10. Os 5 tubos de ágar mole triptona esterilizados são retirados e aquecidos num banho de água a 100 ° C, de modo a derreter o agar. Os tubos são resfriados e os tubos macios moles são mantidos a 45 ° C.
11. Entre os 10 tubos acima contendo fagos em diferentes concentrações, cinco tubos (isto é, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 e 10 -9 ) são selecionados. A partir destes tubos, transfere-se assepticamente 1 ml de cada vez para os cinco tubos de agar macio de triptona, utilizando pipetas esterilizadas separadas.
12. Duas gotas de cultura em meio nutriente da bactéria (Ex: Escherichia coli B) são assepticamente transferidas, preferivelmente em uma câmara de fluxo laminar, para cada tubo de agar macio triptona contendo o bacteriófago em cinco concentrações diferentes (10 -5 a 10 -9 ).
13. O conteúdo dos cinco tubos de ágar mole triptona contendo o bacteriófago e as bactérias são rapidamente misturados por rotação entre as palmas das mãos.
14. O conteúdo é vertido assepticamente sobre as cinco placas de agar duro com triptona marcadas com 10-5 a 10-9, formando assim uma preparação de cultura em placa de dupla camada. As placas são rodadas suavemente e deixadas endurecer.
15. As placas são incubadas na posição invertida a 37 ° C em uma incubadora.
Observações:
1. Todas as placas são observadas para unidades formadoras de placas (PFUs) que se desenvolvem como zonas claras no gramado das bactérias.
2. Apenas as placas com PFU entre 30 e 300 são consideradas para enumeração de fagos. O número de PFUs em cada placa é contado. Placas mostrando mais de 300 PFUs são designadas como 'muito numerosas para contar' (TNTC), enquanto placas que exibem menos de 30 PFUs são designadas 'muito poucas para contar' (TFTC). Tais placas não são consideradas.
3. Com base nas observa�es, o n�ero de bacteri�agos por mL da cultura de reserva de fago � calculado utilizando a seguinte f�mula.
Nº de fagos / ml = nº de PFUs X fator de diluição
Por exemplo, se o número de PFUs é 280 numa diluição de 10-7, então o número de fagos na cultura de reserva do fago é de 280 x IO7 fagos / ml (= 2, 80 x IO9 fagos / ml).
