Replicação do DNA: Notas sobre replicação semi-conservadora de DNA

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A replicação é o processo de formação de cópias de carbono. Para isso, o DNA funciona como um modelo próprio. Portanto, a replicação do DNA é uma função autocatalítica do DNA.

Imagem Cortesia: ehrig-privat.de/ueg/images/dna-replic.jpg

Geralmente ocorre durante a fase S do ciclo celular, quando os cromossomos estão em uma forma altamente estendida. Como proposto por Watson e Crick, a replicação do DNA é semiconservativa (um tipo de replicação em que um filamento do duplex filha é derivado do pai enquanto o outro filamento é formado de novo).

Isso é realizado pela separação de dois fios. Os segmentos separados funcionam como modelos. Os novos fios construídos sobre os moldes dos fios antigos terão pares de bases complementares (A oposto a T e G oposto a C). As duas filhas de moléculas de DNA assim formadas serão cópias de carbono da molécula parental, mas terão uma nova vertente e uma vertente antiga.

Taylor et al (1957) alimentaram células em divisão de pontas das raízes de feijão largo (Vicia faba) com timina 3H radioativa em vez de timina normal. A timina é incorporada no DNA, que é o elemento estrutural dos cromossomos. Taylor et al descobriram que todos os cromossomos se tornaram radioativos.

A timina marcada foi então substituída por uma normal. A próxima geração passou a ter radioatividade em uma das duas cromátides de cada cromossomo, enquanto na geração seguinte a radioatividade estava presente em 50% dos cromossomos (Fig. 6.9). Isto é possível somente se das duas cadeias de um cromossomo, uma for formada de novo, enquanto a outra é conservada em cada replicação, isto é replicação semiconservativa.

A replicação semi-conservadora do DNA foi comprovada pelo trabalho de Mathew Meselson e Franklin Stahl (1958). Eles cresceram Escherichia coli por muitas gerações em meio contendo isótopo pesado de nitrogênio, na forma de ¹⁵ NH ₄ Cl, até que o DNA bacteriano ficou completamente marcado com isótopo pesado.

As bactérias marcadas foram então transferidas para meio fresco com azoto normal ou 14N. As amostras foram coletadas para cada geração (uma geração leva 20 minutos, pois a E. coli se divide em 20 minutos) e o DNA foi testado para o isótopo pesado de nitrogênio através de centrifugação em gradiente de densidade usando cloreto de césio. O cloreto de césio é um sal pesado altamente solúvel em água.

Quando girado em centrífuga a alta velocidade (digamos 50.000 rotações por minuto) o sal forma um gradiente de densidade com a região mais concentrada mais pesada na parte inferior e a menos concentrada sucessivamente menos voltada para a superfície. Quando o DNA é misturado com o cloreto de césio, ele se estabiliza em uma altura particular em centrifugação, mais pesada em direção à base e mais clara em uma posição mais alta (Fig. 6.10).

O fluorocromo, chamado brometo de etídio, é usado para melhorar o contraste, pois o fluorocromo é específico para o DNA. Meselson e Stahl descobriram que o DNA da primeira geração era híbrido ou intermediário ( ¹⁵ N e ¹⁴ N). Estabeleceu-se em solução de cloreto de césio a um nível mais alto que o DNA completamente etiquetado de bactérias parentais ( ¹⁵ N ¹⁵ N). A segunda geração de bactérias após 40 minutos continha dois tipos de DNA, 50% de luz ( ¹⁴ N ^I4 N) e 50% de intermediário ( ¹⁵ N ^I4 N).

A terceira geração de bactérias após 60 minutos continha dois tipos de DNA, 25% de intermediário ( ¹⁵ N ¹⁴ N) e 75% de luz ( ¹⁴ N ¹⁴ N) na proporção de 1: 3. A quarta geração após 80 minutos continha 12, 5% ^de 15N14N e 87, 5% ^de ADN de 14N14N numa proporção de 1: 7.

Essa observação é possível somente se as duas cadeias de DNA duplex se separarem no momento da replicação e agirem como um modelo para a síntese de novas cadeias complementares de DNA com normal ou ^14N . Isso produzirá dois duplexes de DNA com uma cadeia antiga ( ¹⁵ N) e um novo fio ( ¹⁴ N).

Durante a formação da segunda geração, as cadeias de DNA de 15N e 14N separam-se para funcionar como moldes, de modo que 50% dos novos duplexes de DNA possuem apenas filamentos normais ou ^l4N, enquanto outros 50% têm ambas as cadeias 15N e 14N (Figs 6.11 e 6.12). Deste modo, a cada replicação, uma cadeia de ADN parental é conservada na filha enquanto a segunda é sintetizada de fresco.