Replicação de DNA: Notas sobre Replicação, Reparo e Recombinação de DNA

Notas sobre Replicação, Reparo e Recombinação de DNA!

Replicação de DNA:

Replicação semi-conservadora do DNA:

A replicação do DNA é uma função autocatalítica do DNA. Geralmente ocorre durante a fase S do ciclo celular, quando os cromossomos estão em uma forma altamente estendida. Conforme proposto por Watson e Crick, a replicação do DNA é semi-conservadora.

Na replicação semi-conservativa, os dois filamentos se separariam um do outro, manteriam sua integridade e cada um sintetizaria, a partir do pool de nucleotídeos, sua cadeia complementar. O resultado seria que a molécula recém-sintetizada transportaria ou conservaria uma das duas cadeias da molécula mãe e a outra vertente seria montada novamente. Há evidências suficientes para provar que o DNA de fita dupla realmente se reproduz pelo método semi-conservador.

Experiência de Meselson e Stahl (1958):

Esses trabalhadores cultivaram Escherichia coli em meio contendo ¹⁵ isótopos de N. Depois de estes terem se replicado por algumas gerações naquele meio, ambos os filamentos deste DNA continham ¹⁵ N como constituintes de purinas e pirimidinas. Quando estas bactérias com ¹⁵ N foram transferidas para um meio de cultura contendo ¹⁴ N, verificou-se que o DNA separado da nova geração de bactérias possui uma cadeia mais pesada que a outra.

O filamento mais pesado representa o filamento parental e o filão mais leve é o novo sintetizado a partir do meio de cultura, indicando assim um método semi-conservativo de replicação do DNA e excluindo os modelos conservativo e dispersivo de síntese e replicação de DNA.

A replicação conservadora não produziria nenhuma molécula de DNA com uma constituição “híbrida”. Se a replicação fosse dispersiva, teria havido uma mudança do DNA de "pesado para" luz "através de cada geração.

Estudos subseqüentes verificaram a conclusão de Meselson e Stahl de que a replicação do DNA é semiconservativa e a estendeu a muitos outros organismos, incluindo plantas e animais superiores.

Experimento de autoradiografia de Cairn:

Ele usou timina radioativa ou timidina tritiada. Por crescimento de E. coli em meio de cultura contendo timidina tritiada, a radioactividade foi incorporada nas moléculas de DNA filha.

Na autorradiografia, a molécula de DNA em duplicata mostra uma bifurcação replicante, o ponto em que duas cadeias se tornam quatro. Após a primeira replicação, a radioactividade é vista como sendo incorporada em apenas uma das cadeias de ADN e ambas as cadeias são identificadas como sendo marcadas após a segunda replicação. Isso suporta os modos semiconservativos de replicação de DNA.

Os experimentos de JH Taylor em dicas de raiz de Viciafaba (1957) também confirmam o método semi-conservativo de replicação de DNA.

Eu. Replicação de DNA descontínua:

Okazaki sugeriu que a síntese de DNA prossegue simultaneamente em ambas as cadeias de DNA, utilizando a mesma enzima DNA polimerase na forma de pequenos fragmentos isolados. Esses segmentos são conhecidos como peças de Okazaki e consistem em 1000-2000 nucleotídeos. Estes são unidos pela enzima polinucleotídeo ligase, completando a formação da cadeia polinucleotídica.

A síntese descontínua de DNA é apoiada por experimento auto-radiográfico.

ii. Replicação Unidirecional e Bidirecional de DNA:

J. Cairns de seus experimentos concluiu que a síntese de DNA começa em um ponto fixo nos cromossomos e prossegue em uma direção, mas experimentos recentes sugerem uma replicação bidirecional.

Levinthal e Cairns propuseram que, durante a replicação, as duas vertentes não se separassem completamente antes da replicação. Em vez disso, eles começam a descompactar em uma extremidade e, simultaneamente, os segmentos descompactados começam a atrair seus pares de nucleotídeos. Desta forma, o descompactamento das fitas originais de DNA e a síntese de novas fitas de DNA caminham lado a lado.

DNA polimerase:

A DNA polimerase é a principal enzima da replicação do DNA. Sua atividade foi demonstrada primeiramente por Kornberg em 1956. Catalisa a adição covalente de desoxirribonucleotídeos ao 3'-OH de um nucleotídeo preexistente chamado primer.

A enzima DNA polimerase-1 é agora considerada uma enzima de reparo de DNA em vez de uma enzima de replicação. Sabe-se que esta enzima tem cinco sítios ativos, nomeadamente sítio modelo, local de primer, 5 '-> 3' clivagem ou local de exonuclease, local de trifosfato de nucleósido e local de clivagem 3 '-> 5' (ou local de exonuclease 3 '-> 5' ).

DNA polimerase I:

Está principalmente envolvida na remoção de primers de RNA de Okazaki ou fragmentos precursores e preenchendo as lacunas resultantes devido à sua capacidade de polimerização 5 '-> 3'. A enzima DNA polimerase I também pode remover os dímeros de timina produzidos devido à irradiação UV e preencher o intervalo devido à excisão. Isso é chamado de leitura de prova ou função de edição dessa enzima.

DNA polimerase II:

Esta enzima se assemelha à DNA polimerase-I em sua atividade, mas é uma enzima de reparo de DNA e promove o crescimento na direção 5 '-> 3', usando grupos 3'-OH livres.

DNA polimerase-III:

Ele desempenha um papel essencial na replicação do DNA. É uma enzima multimérica ou holoenzima com dez subunidades, como α, β, ε, θ, γ, γ, δ, δ, x e Ψ. Todas estas dez subunidades são necessárias para a replicação do DNA in vitro; no entanto, todos com funções diferentes. Por exemplo, a subunidade α tem uma atividade de revisão ou edição de exonuclease de 3 '-> 5 ′. A enzima do núcleo compreende três subunidades - α, β e θ. Restantes sete subunidades aumentam a processividade (processividade significa rapidez e eficiência com as quais uma polimerase de DNA se estende à cadeia crescente).

ADN polimerase eucariótica:

Os ekai yotes (por exemplo, levedura, fígado de rato, células tumorais humanas) contêm os seguintes cinco tipos de DNA polimerases:

i) DNA polimerase α:

Esta enzima de peso molecular relativamente alto é também chamada polimerase citoplasmática ou polimerase grande. Encontra-se tanto no núcleo como no citoplasma.

(ii) DNA polimerase β:

Esta enzima também é chamada polimerase nuclear ou polimerase pequena e é encontrada apenas em vertebrados.

(iii) DNA polimerase y:

Esta enzima é chamada polimerase mitocondrial e é codificada no núcleo.

(iv) DNA polimerase δ:

Esta enzima é encontrada em células de mamíferos e é dependente de PCNA para a processabilidade de síntese de DNA (PCNA = antígeno nuclear de proliferação celular).

(v) DNA polimerase ε:

Anteriormente era conhecido como DNA polimerase 5II. Esta enzima é independente de PCNA e ocorre em células HeLa de mamífero e levedura em flor.

A grande DNA polimerase a é a enzima predominante DNA polimerase é células eucarióticas e foi acreditado por muito tempo para ser a única enzima envolvida na replicação do DNA. Mas agora, mais uma polimerase, nomeadamente a ADN-polimerase 8, está também envolvida na replicação de ADN eucariótica.

Primers DNA:

Estas enzimas catalisam a síntese de iniciadores de RNA que são um pré-requisito para o início da replicação do DNA na grande maioria dos organismos. Antes do início da replicação do ADN, os segmentos curtos de oligonucleótidos de ARN, denominados iniciadores de ARN ou simplesmente os iniciadores, têm de ser sintetizados pela enzima primária de ADN utilizando trifosfatos de ribonucleósidos.

Este iniciador de ARN sintetizado por copiar uma sequcia de bases particular de uma cadeia de ADN e difere de uma molula de ARN tica na medida em que, ap a stese, o iniciador permanece ligado por hidrogio ao molde de ADN.

Os iniciadores têm cerca de 10 nucleótidos de comprimento em eucariotas e são feitos em intervalos no fio atrasado, onde são alongados pela enzima DNA polimerase para iniciar cada fragmento de okazaki. Esses iniciadores de RNA são posteriormente excisados e preenchidos com DNA, com a ajuda do sistema de reparo de DNA em eucariotos.

Em bactérias, duas enzimas diferentes são conhecidas por sintetizar oligonucleótidos de RNA primers - RNA polimerase (na cadeia principal) e DNA primo (na cadeia atrasada).

Polinucleótido Ligase:

Esta enzima é uma importante enzima tanto na replicação do DNA quanto no reparo do DNA. A DNA ligase catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre o grupo 5'-fosforil de um nucleotídeo e o grupo 3-OH do vizinho imediato no lado de um nick em uma fita de DNA; Assim, sela os cortes em uma fita de DNA.

Endonucleases:

As endonucleases, particularmente as endonucleases de restrição, também são importantes durante a replicação do DNA, bem como no reparo do DNA. Durante a replicação do DNA, uma endounclease pode produzir um nick na origem para iniciar a replicação ou pode induzir nicks a gerar um giro para facilitar o desenrolamento do DNA.

Enzimas Envolvidas na Abertura da DNA Helix:

DNA helicases:

As helicases de ADN são enzimas de desenrolamento dependentes de ATP que promovem a separação das duas cadeias parentais e estabelecem garfos de replicação que se afastarão progressivamente da origem. O desenrolamento da hélice-modelo de DNA em uma forquilha de replicação poderia, em princípio, ser catalisada por duas helicases de DNA, atuando em conjunto, uma correndo ao longo do cordão principal e a outra ao longo do filamento defasado.

Hélice desestabilizadora de hélice (também designada por proteínas de ligação de ADN de cadeia simples ou SSBPs):

Por trás da forquilha de replicação, os filamentos de DNA são impedidos de se rebobinhar um ao outro (ou formar loops de hair-pin de filamento duplo em cada filamento único) pela ação das proteínas SSB. As proteínas SSB ligam-se às fitas de DNA expostas sem cobrir as bases, que, portanto, permanecem disponíveis para o processo de modelagem.

Topoisomerases (DNA gyrases):

A ação de uma helicase introduz um superenrolamento positivo no DNA duplex à frente do garfo de replicação. As enzimas, chamadas topoisomerases, relaxam o superenrolamento ligando-se ao dúplex supervelil transiente, cortando um dos filamentos e girando-o através do cordão ininterrupto. O nick é então fechado novamente.

Um tipo de topoisomerase (isto é, topoisomerase I) provoca uma quebra ou entalhe de fita única que permite que as duas seções da hélice de DNA de cada lado do entalhe girem livremente em relação uma à outra, usando a ligação fosfodiéster na cadeia oposta ao entalhe como um ponto giratório. Um segundo tipo de topoisomerase (isto é, topoisomerase II) forma uma ligação covalente a ambas as cadeias da hélice do DNA ao mesmo tempo, fazendo com que a cadeia dupla transitória quebre na hélice.

Replicon:

Um replicon é a unidade de DNA na qual ocorrem atos individuais de replicação, isto é, é capaz de replicação de DNA independente de outros segmentos de DNA. Portanto, cada réplica tem uma origem na qual a replicação é iniciada e pode ter um terminal no qual a replicação é interrompida.

Os cromossomos bacterianos e virais geralmente contêm um único replicon / cromossomo. Embora o fago T tenha duas origens, uma primária e uma secundária, mas na presença de origem primária a origem secundária é, via de regra, não funcional. Em E. coli, o ponto de origem é identificado como locus genético oriC.

Uma origem procariica completa suporta as tr seguintes funes: (1) iniciao da replicao, (2) controlo da frequcia dos eventos de iniciao e (3) segregao dos cromossomas replicados nas culas filhas.

Origens foram identificadas em bactérias, leveduras, cloroplastos e mitocôndrias; sua característica geral significativa é que eles são ricos em A: T, o que pode ser importante para facilitar o desenrolar durante a replicação. A origem bacteriana contém muitos locais curtos (<10 pb) diferentes que são necessários para sua função; esses sites são às vezes separados por distâncias específicas, mas não por sequências específicas. Estes locais especificamente localizados são necessários para a ligação de diferentes proteínas envolvidas na replicação do DNA.

Vários replicons procarióticos possuem sites específicos, chamados de terminus, que param o movimento do garfo de replicação e, assim, terminam a replicação do DNA. O cromossomo de E. coli tem dois terminais, chamados T ₁ e T _2, localizados em torno de 100 Kb em cada lado do ponto onde os garfos de replicação se encontrariam. Cada terminal é específico para uma direção do movimento do garfo.

Os T ₁ e T ₂ são dispostos de tal maneira que cada garfo deve passar pelo outro para alcançar o término específico para ele. A terminação de replicação requer o produto do gene tus, que provavelmente codifica uma proteína que reconhece T e T ₂ .

Em eucariotos, cada cromossomo possui vários replicons (por exemplo, levedura, 500; Drosophila, 3500; rato 25.000; Viciafaba, 35.000). Em qualquer ponto dado durante a fase S, apenas alguns desses replicons passam por replicação; cada replicon parece ser ativado em um tempo específico em uma seqüência específica. O comprimento de um replicon eucariótico pode variar de 40 Kb em levedura e Drosophila a aproximadamente 300 Kb em Vicia.

O número de replicões detectáveis parece variar com o estágio de desenvolvimento e o tipo de célula ou tecido. Isso é explicado com base nas origens específicas do tecido, de modo que algumas origens estão ativas em alguns tecidos, enquanto outras estão ativas em alguns outros tecidos.

Isto é exemplificado pela Drosophila, onde as primeiras células embrionárias têm 10 vezes mais replicões do que as células somáticas adultas. A evidência disponível sugere que os replicons eucarióticos não possuem terminus.

Fidelidade de replicação:

A taxa de erro da replicação do DNA é muito menor do que a da transcrição, devido à necessidade de preservar o significado da mensagem genética de uma geração para a seguinte. Por exemplo, a taxa de mutação espontânea em E. coli é de cerca de um erro por 10 ¹⁰ bases incorporadas durante a replicação.

Isto é devido principalmente à presença das formas tautoméricas menores das bases que alteraram as propriedades de emparelhamento de bases. A taxa de erro é minimizada por vários mecanismos. As polimerases de DNA só incorporarão um nucleotídeo entrante se formar o par de bases correto com o nucleotídeo modelo em seu sítio ativo.

O erro ocasional é detectado pela exonuclease de revisão 3 '-> 5' associada à polimerase. Isso remove o nucleotídeo incorreto da extremidade 3 'antes de qualquer outra incorporação, permitindo que a polimerase insira a base correta. Para que a exonuclease de revisão funcione corretamente, ela deve ser capaz de distinguir um par de bases correto de um incorreto.

A maior mobilidade dos pares de base "não ancorados" no extremo 5 'dos fragmentos de DNA atrasados, iniciados de novo, significa que eles nunca podem parecer corretos e, portanto, não podem ser corrigidos. Assim, os primeiros poucos nucleotídeos são ribonucleotídeos (RNA), de modo que, posteriormente, possam ser identificados como material de baixa fidelidade e substituídos por DNA alongado (e revisado) do fragmento adjacente. Os erros que escapam da revisão são corrigidos por um mecanismo de reparo de incompatibilidade.

Mecanismo de Replicação do DNA em Procariontes:

A replicação de DNA in vitro tem sido extensivamente estudada em E. coli e nos fagos e plasmídeos de E. coli. Em E. coli, o processo de replicação do DNA envolve três etapas principais:

1. Iniciação da replicação do DNA:

Este processo compreende três etapas: (i) reconhecimento da origem (O), (ii) abertura do duplex de DNA para gerar uma região de DNA de fita simples, e (iii) captura da proteína Dna B (ie, 5 ′ 3 ′ helicase também atua como ativador da primase). Assim, o complexo ATP Dna-A (ou proteína iniciadora) liga-se a regiões de repetição invertidas de 9 pb (R,, R,, RvR4) de ori C de E. coli e promove a abertura do duplex de DNA numa região de três repetições diretas da sequência de 13 pb (chamadas 13-meros).

A abertura ocorre do lado direito de 13 meros e requer DNA negativamente superenrolado e proteínas iniciadoras HU ou IHF. O ADN B (-helicase) é transferido para ADN de cadeia simples exposto e causa o desenrolar do ADN na presença de proteína ATP, SSB e ADN-girase (uma topoisomerase).

Isso resulta no desenrolar do duplex do DNA e a replicação do ori C procede em ambas as direções (bidirecional); A ligaï¿½o de SSB ocorre em regiï¿½s de cadeia simples e dois complexos de Dna B (= primossomas) sï¿½ carregados em cada cadeia.

2. Alongamento da cadeia de DNA:

Esta etapa requer a presença das seguintes enzimas e fatores: 1. Dna B ou helicase (também chamado de promotor móvel); 2. primase (Dna G); 3. Holoenzima DNA polimerase (ou DNA pol III HE); 4. proteï¿½a SSB; 5. RNAase H que remove iniciadores de RNA; 6. DNA polimerase I que é usado para preencher a lacuna criada devido aos iniciadores de RNA e 7. DNA ligase (que converte os fragmentos de okazaki sem primer em cadeia contínua). Durante o início da transição de alongamento, os seguintes eventos ocorrem:

(i) À medida que a helicase (ou Dna B) se desloca na direção 5> -> 3,, ela gera uma bifurcação de replicação abrindo o duplex de DNA.

(ii) O cordão de DNA com helicase torna-se o cordão de atraso. O ADN primase associa-se com a helicase de DnaB, formando o primossoma que sintetiza múltiplos iniciadores para a cadeia de retardamento e o iniciador de ARN simples para a cadeia principal.

(iii) Para a síntese do filamento defasado, o DNA pol III HE tem que trabalhar no mesmo filamento ao qual a helicase de Dna B está ligada, mas ela viaja na direção oposta.

(iii) DnaB helicase, Dna Gprimase e DNA pol III FIE trabalham em conjunto no alongamento da cadeia. A helicase e a montagem da DNA polimerase permanecem processuais, ou seja, permanecem firmemente ligadas ao garfo e permanecem encadernadas por toda a reação.

A síntese (- alongamento) das fitas atrasadas e principais ocorre através de métodos um pouco diferentes; é muito mais complexo para a cadeia atrasada do que para a vertente líder:

(A) Síntese descontínua na fita atrasada:

1. O Primase é retirado da solução e é ativado pela helicase (DnaB) para sintetizar o primer aRNA (10 a 20 nt ou nucleotídeos de comprimento) no filamento defasado.

2. Os iniciadores de RNA são reconhecidos por DNA pol III HE no cordão de retardamento e são utilizados para a síntese de fragmentos de precursor ou okazaki. De fato, cada novo primer de RNA é reconhecido pela subunidade gama (y) do DNA pol III HE e carregado com a subunidade p da mesma polimerase. Esta subunidade p pré-carregada pode então capturar o núcleo do DNA poli III HE quando este estiver disponível após o término de seu trabalho sintético no fragmento de okazaki anterior.

3. Após a conclusão dos fragmentos de okazaki, os iniciadores de RNA são excisados pela DNA polimerase 1, que então preenche as lacunas resultantes com DNA.

4. Após a DNA polimerase I adicionar os desoxirribonucleótidos finais no intervalo deixado pelo iniciador excisado, a enzima DNA ligase forma a ligação fosfodiéster que liga a extremidade 3 'livre da substituição do iniciador à extremidade 5' do fragmento de okazaki.

(B) síntese contínua na vertente principal:

1. Na replicação bidirecional do DNA, o filamento principal é preparado uma vez em cada um dos filamentos parentais.

2. O iniciador de RNA da cadeia principal é sintetizado pela enzima RNA polimerase.

3. O ADN pol III HE provoca o alongamento do cordão principal e, finalmente, as enzimas DNA pol 1 e ligase dão um toque final ao filamento principal, como no caso do filamento defasado.

Replicação de DNA em eucariotos :

A replicação de DNA eucariótica requer duas enzimas DNA polimerase diferentes, nomeadamente DNA polimerase a e DNA polimerase δ. A DNA polimerase δ sintetiza o DNA na cadeia principal (síntese contínua de DNA), enquanto a DNA polimerase a sintetiza o DNA na cadeia retardada (síntese descontínua de DNA). Além destas duas enzimas, replicação do DNA: (1) antígeno T; (2) factor de replicação A ou RF-A (também designado por RP-A ou SSB eucariótico); (3) topoisomerase I; (4) topoisomerase II; (5) antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA, também chamado ciclina) e (6) fator de replicação Cor RF-C.

O processo de replicação eucariótica do DNA envolve os seguintes passos:

1. Antes do início da síntese de DNA, há um estágio pré-sintético de 8-10 minutos de duração para a formação do complexo de DNA desenrolado. Este passo necessita apenas de três proteínas purificadas, nomeadamente o antigénio T (T-ag ou antigénio tumoral), RF-A e topiosomerases I e II.

2. O antígeno T, usando seu domínio de ligação ao DNA, forma um complexo de múltiplas subunidades com o sítio I e o sítio II na presença de A TP e causou o desenrolamento local.

3. O desbobinamento duplex mais extenso ocorre devido à associação de RF-A e uma topoisomerase com - a ajuda do componente helicase do DNA das Topoisomerases T-ago ajudam no desenrolamento do DNA alterando a topologia do DNA na forquilha de replicação.

4. As proteínas RF-A ou SSB ligam-se ao DNA de fita simples desenrolado.

5. A sï¿½tese de RNA iniciador ï¿½realizada por primase que estï¿½ firmemente associada a DNA polimerase ex.

6. DNA polimerase a ajuda na síntese de um fragmento de okazaki na direção de 5 ′ a 3 ′.

7. O factor de replicao C (ou RF-C) e o PCNA (ciclina) ajudam na comutao de polimerases de ADN, de modo a que a pola seja substitua por pol5 que, depois, sintetiza continuamente ADN na cadeia principal.

8. Outro fragmento de okazaki é então sintetizado a partir do garfo de replicação na fita atrasada pelo complexo pola-primase e esta etapa é repetida várias vezes, até que toda a molécula de DNA seja coberta.

9. Os primers de RNA são removidos e as lacunas são preenchidas como na replicação de DNA procariótica.

Recentemente, o papel da DNA polimerase e na replicação do DNA tem sido enfatizado, de modo que três DNA polimerases (a, δ e ε) são agora conhecidas por estarem envolvidas na replicação do DNA eucariótico. A. Sugino e colaboradores propuseram que a DNA polimerase a poderia atuar tanto na cadeia principal quanto na retardada (já que a polimerase a tem atividade α primase), enquanto a polimerase e e a polimerase 5 estão envolvidas no alongamento das cadeias principal e tardia respectivamente.

Danos no DNA e Mecanismo de Reparo

Tipos de danos no DNA:

1. lesões de DNA:

Uma alteração na estrutura química ou física normal do DNA é chamada de lesão de DNA. Muitos agentes exógenos, como produtos químicos e radiação, podem causar alterações nas posições de átomos de nitrogênio e carbono nos sistemas de anéis heterocíclicos das bases e em alguns dos grupos funcionais exocíclicos (isto é, os grupos ceto e amino das bases).

Isso pode levar à perda de emparelhamento de bases ou ao emparelhamento de bases alterado (por exemplo, um A alterado pode emparelhar com C em vez de T). Se tal lesão for permitida permanecer no DNA, uma mutação pode ser fixada no DNA por mutagênese direta ou indireta.

Alternativamente, a alteração química pode produzir uma distorção física no DNA que bloqueia a replicação e / ou a transcrição, causando a morte celular. Assim, as lesões de DNA podem ser mutagênicas e / ou letais. Algumas lesões são espontâneas e ocorrem devido à reatividade química inerente ao DNA e à presença de espécies químicas normais e reativas dentro da célula.

Por exemplo, a citosina base sofre desaminação hidrolítica espontânea para dar uracilo. Se deixado sem reparar, o uracilo resultante formaria um par de bases com adenina durante a replicação subsequente, dando origem a uma mutação pontual. A depurinação é outra reação hidrolítica espontânea que envolve a clivagem da ligação N-glicosil entre N-9 das bases purinas A e G e C-l 'do açúcar desoxirribose e, portanto, a perda de bases purinas do DNA. O esqueleto de açúcar-fosfato do DNA permanece intacto. O sítio apurínico resultante é uma lesão não codificante, pois a informação codificada nas bases purinas é perdida.

2. Danos oxidativos:

Isso ocorre em condições normais devido à presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) em todas as células aeróbicas, por exemplo, superóxido, peróxido de hidrogênio e, mais importante, o radical hidroxila (OH). Este radical pode atacar o DNA, em vários pontos, produzindo uma série de produtos de oxidação com propriedades alteradas de II, por exemplo, 8-oxoguanina, 2-oxoadenina e 5-formiluracila. Os níveis destes podem ser aumentados por radicais hidroxilo da radiólise da água causada por radiação ionizante.

3. Alquilação:

Agentes alquilantes são substâncias químicas eletrofílicas que prontamente adicionam grupos alquila (por exemplo, metil) a várias posições em ácidos nucléicos distintos daqueles metilados por enzimas de metilação normais. Exemplos comuns são o sulfonato de metileno (MMS) e etilnitrosoureia (ENU).

Exemplos típicos de bases metiladas são 7-metilguanina, 3-metil-adenina, 3-metilguanina e 0 ⁶ -metilguanina. Algumas dessas lesões são potencialmente letais, pois podem interferir no desenrolar do DNA durante a replicação e transcrição. A maioria também é indiretamente mutagênica; no entanto, a 0 ^6- metilguanina é uma lesão mutagênica direta, pois pode ser pareada com timina durante a replicação.

4. adutos volumosos:

Os deros de pirimidina de ciclobutano s formados por luz ultravioleta de pirimidinas adjacentes numa cadeia por ciclizao dos omos de carbono C5 e C6 de ligao dupla de cada base para dar um anel de ciclobutano. A perda resultante de emparelhamento de bases com a cadeia oposta causa desnaturação localizada do ADN, produzindo uma lesão volumosa que iria interromper a replicação e a transcrição. Outro tipo de dímero de pirimidina, o fotoproduto 6, 4, resulta da formação de uma ligação entre C6 de uma base de pirimidina e C4 da base adjacente.

Quando o carcinogéneo benzo [a] pireno do alcatrão de carvão é metabolizado no citocromo P-450 no fígado, um dos seus metabolitos (um epóxido diol) pode ligar-se covalentemente ao grupo 2-amino dos resíduos de guanina. Muitos outros agentes arilantes aromáticos formam aductos covalentes com DNA. O fígado carcinogênico aflatoxina B, também se liga covalentemente ao DNA.

Reparo de DNA:

Os sistemas de reparo reconhecem uma variedade de mudanças no DNA para iniciar a ação. Uma célula pode ter vários sistemas para lidar com danos no DNA. Estes sistemas incluem o seguinte: (1) Reparo direto, (2) Reparo de excisão (3) Reparo de incompatibilidade, (4) Sistemas tolerantes e (5) Sistemas de recuperação.

1. reparo direto:

A reversão ou simples remoção do dano ao ADN é conhecida como reparação directa, por exemplo, remoção das ligações covalentes entre os dois e dois 5 carbonos dos dois resíduos de timina que participam na formação de dímeros de timina.

Os dímeros de timina são geralmente formados devido à irradiação UV e interferem na replicação e transcrição. Kelner (1949) observou que um grande número de bactérias poderia sobreviver a grandes doses de radiação UV; se eles foram expostos a uma fonte intensa de luz visível.

Esse fenômeno é chamado de fotorreativação. Mais tarde, foi demonstrado que, durante a irradiação UV, uma determinada enzima é seletivamente ligada ao DNA bacteriano. Durante o processo de foto-reativação, a enzima é ativada pela luz visível. Cliva os dímeros de timina, restaurando-os assim à sua forma original. Este processo de reparo é mediado por enzima e depende da luz.

2. reparo da excisão:

Neste mecanismo de reparo, o segmento danificado ou alterado da fita de DNA é extirpado e um novo patch de DNA é sintetizado em seu lugar. Embora os sistemas de reparo de excisão variem em sua especificidade, o caminho principal envolve as três etapas a seguir:

(i) Reconhecimento e Incisão:

A seção danificada / alterada de uma fita de DNA é reconhecida por uma endonuclease; esta enzima então corta o filamento afetado em ambos os lados do dano.

ii) excisão:

Uma exonuclease de 5 ′ -> 3 ((DNA polimerase I) digere a seção danificada / alterada; isso gera uma região de fita simples na dupla hélice do DNA.

(iii) Síntese:

Neste passo, a região de cadeia simples produzida por excisão serve como molde para uma polimerase de ADN que sintetiza a substituição para o segmento excisado. A DNA ligase então sela o nick que permanece após a síntese da substituição para a seção excisada.

Em E. coli, a excisão é mais provável devido à atividade de exonuclease de 3 ′ -> 5 of da DNA polimerase I, enquanto a síntese é realizada pela atividade da polimerase 5 ′ -> 3 of da mesma enzima. Os sistemas de reparo por excisão são bastante comuns em procariotas e eucariotos. Alguns desses sistemas reconhecem danos gerais ao DNA, enquanto outros são muito específicos, por exemplo, as endonucleases AP removem os resíduos de ribose dos locais de depurinação. O reparo de excisão envolve diferentes comprimentos de DNA e é agrupado nas três classes a seguir:

(a) Reparo de patch muito curto (VSP):

Este sistema lida com o reparo de incompatibilidades entre bases específicas.

(b) Reparação de remendo curta:

Neste sistema, cerca de 20 bases de cadeia de DNA longa é excisada, e os danos são reparados através de genes uvr (uvr, A, B, C, de E. coli), codificando para componentes de uma endonuclease de reparação. Outra enzima uvr D também é necessária para a atividade da helicase.

(c) Reparo de remendo longo:

Este sistema envolve a excisão de segmentos de cerca de 1500 bases, mas às vezes o segmento extirpado pode ser> 9000 bases. É muito menos comum e tem que ser induzido por danos que bloqueiam a replicação. Em E. coli, este sistema também envolve os genes uvr e DNA polimerase I.

3. Reparação Incompatível:

Envolve a correção de incompatibilidades ou o pareamento entre bases que não são complementares. Incompatibilidades podem surgir (a) durante a replicação ou (b) devido a alterações de base (por exemplo, desaminação da citosina ao uracilo) e resulta em distorções estruturais na dupla hélice do DNA. Estas alternações são tratadas em E. coli pelo sistema de reparação de excisão de retalhos muito curtos que é descrito abaixo.

Sistema de Reparação Incompatível em E. coli:

Quando há uma incompatibilidade em um par de bases como em GC -> GT, então, teoricamente, ele pode reparar para dar origem ao tipo selvagem (GC) ou a um tipo mutante (AT). Portanto, o sistema de reparo tem que distinguir entre os fios antigos e novos e reparar apenas o novo fio para restaurar o tipo selvagem.

Isso é feito por um sistema de reparo de excisão de patch muito curto e requer quatro proteínas denominadas Mut L, Mut S, Mut U e Mut H codificadas em E. coli respectivamente pelos genes mut L, mut S, mut U e mut H. Os erros de incompatibilidade produzidos durante a replicação são corrigidos pelo sistema de reparação de barragens.

O gene dam de E. coli produz uma metilase que metilate adenina da sequência GATC em ambas as cadeias de DNA. A replicao de uma sequcia de GATC totalmente metilada produz uma sequcia hemimetilada na qual os resuos A nas cadeias recentemente sintetizadas s n metilados.

O estado não metilado desta sequência alvo é utilizado para identificar a nova cadeia; as bases em torno do local da incompatibilidade na nova cadeia são extirpadas e uma substituição é sintetizada. O sistema envolve os produtos dos genes mut L, mut S, mut H e uvr D.

Reparos de Sistemas de Recuperação:

Esses sistemas também são conhecidos como 'reparo pós-replicação' ou 'reparo de recombinação'. Em E. coli, esse sistema de reparo é baseado no gene rec A, que produz a proteína Rec A. Rec A proteína funciona na troca de cadeias entre moléculas de DNA durante a recombinação genética e também funciona na troca de cadeia única durante o reparo de recombinação. Parece haver duas vias rec A, uma envolvendo os genes rec B, C e a outra envolvendo rec F.

Este sistema de reparo opera quando uma distorção estrutural bloqueia a replicação no local danificado. Por exemplo, os mutantes de E. coli deficientes no reparo por excisão não serão capazes de remover os dímeros de timina. Em tal situação, a replicação procede normalmente até os sites danificados; a DNA polimerase interrompe a replicação do filamento afetado e reinicia a replicação ignorando o local danificado.

A cadeia complementar é replicada normalmente no local danificado na outra cadeia. Portanto, a replicação produz uma progênie normal de molécula de DNA e uma molécula que possui o dímero de timina em uma fita e uma lacuna longa em sua fita complementar. A molécula de DNA da progênie com o dímero de timina seria perdida a menos que seja reparada preenchendo a lacuna em um de seus filamentos.

Isto é conseguido por meio de troca de cadeia simples entre as duas moléculas de DNA da progênie; a região de troca preenche a lacuna e é induzida pela proteína Rec A. Como resultado desta troca, a molécula de progênie normal possui uma região de fita simples que possui um intervalo. Essa lacuna é reparada pela síntese de DNA.

Sistema de tolerância:

Esses sistemas lidam com os danos que bloqueiam a replicação normal no local danificado, possivelmente permitindo a replicação dos sites danificados com uma alta frequência de erros. Estes sistemas podem ser particularmente importantes nos eucariotos, onde o tamanho do genoma é muito grande e, portanto, um reparo completo do dano é bastante improvável.