Replicação do DNA: mecanismos de replicação do DNA

Alguns dos modos mais importantes de replicação do DNA são os seguintes!

A replicação do DNA em eucariotos é semiconservativa, semi-descontínua e bidirecional quando comparada a semiconservativa, bidirecional e contínua em procariotos.

Imagem Cortesia: dbriers.com/tutorials/wp-content/uploads/2012/12/DNA_replication_split.png

A replicação do DNA ocorre durante a fase S do ciclo celular. É um processo complexo de várias etapas que requer mais de uma dúzia de enzimas e fatores protéicos. Começa em um ponto específico chamado origem de replicação ou ori. O DNA bacteriano e viral tem uma única origem de replicação. Funciona como uma única unidade de replicação ou replicon.

No DNA eucariótico existem várias origens de replicação. Possui vários segmentos replicantes ou replicons, ou seja, multireplicônicos. Na ausência de ori, a replicação não ocorrerá. O requisito de um vetor para a tecnologia de DNA recombinante é obter a origem de replicação.

A replicação de DNA é energeticamente muito cara. A principal enzima de replicação do DNA é DNA polimerase dependente de DNA. A replicação do DNA é bastante rápida. A replicação de DNA de E. coli com 4, 6 x 10 ⁶ pb requer 19 minutos.

Em uma taxa média de polimerização de bases é de 2000 pb por segundo em cada direção. A replicação requer energia abundante que vem da quebra de trifosfatos de desoxirribonucleotídeos.

A replicação ocorre da seguinte maneira:

1. Ativação de desoxirribonucleotídeos:

Desoxirribonucleotídeos ou monofosfatos desoxirribonucleósidos ocorrem livremente dentro do nucleoplasma. São de quatro tipos - deAMP (monofosfato de desoxiadenosina), deGMP (monofosfato de desoxiguanosina), deCMP (monofosfato de desoxicitidina) e deTMP (monofosfato de desoxitimidina). Eles são primeiro fosforilados e transformados em formas ativas que possuem três resíduos de fosfato em vez de um. A enzima fosforilase é necessária junto com a energia.

Os nucleotídeos fosforilados são deATP (trifosfato de desoxiadenosina), deGTP (trifosfato de desoxiguanosina), deCTP (trifosfato de desoxicitidina) e deTTP (trifosfato de desoxitimidina). Estes trifosfatos de bases servem a duplo propósito. Eles atuam como substrato, bem como fornecem energia para a polimerização de nucleotídeos.

2. Exposição de cadeias de ADN:

A enzima helicase (unwindase) age sobre o local Ori e descompacta (desenrola) os dois filamentos de DNA, destruindo as ligações de hidrogênio. As cadeias separadas são estabilizadas por meio de proteínas de ligação de cadeia simples (SS BPs) ou proteínas estabilizadoras de hélice. Desenrolamento cria tensão na parte não enrolada formando mais superenrolamentos. A tensão é liberada pelas enzimas topoisomerases.

Eles causam o corte e a vedação da fita de DNA. Juntamente com a topoisomerase, as bactérias possuem outra enzima chamada DNA girase, que pode introduzir supercoils negativos (trabalhadores mais velhos acreditavam que a girase funcionava tanto para a helicase quanto para a topoisomerase).

Com a ajuda de várias enzimas, ambos os filamentos de DNA se tornam abertos para replicação. No entanto, todo o DNA não abre em um trecho devido à exigência de energia muito alta. O ponto de separação prossegue lentamente em direção às duas direções. Em cada direção, ela dá a aparência de uma estrutura em forma de Y chamada forquilha de replicação (Fig. 6.13 e 6.14).

3. RNA Primer:

É essencial para a iniciação de novas cadeias de DNA. O primer de RNA é uma pequena fita de RNA que é sintetizada na extremidade 5 'da nova fita de DNA com a ajuda da enzima RNA polimerase específica de DNA chamada primase. O primer de RNA é formado na extremidade livre de um fio e extremidade do garfo do outro fio. A formação de iniciador de RNA constitui a fase de iniciação da síntese de DNA porque, sem a presença de iniciador de RNA, as polimerases de DNA não podem adicionar nucleotídeos.

Uma enzima mais complexa chamada primo some é necessária no fago x 174 e em alguns outros sistemas procarióticos. Em eucariotos, a função da primase é realizada pela enzima DNA polimerase α. Ele constrói ~ 10 RNA de base e 20-30 bases de DNA (Lewin, 2004). Após o início da cadeia nucleotídica, o iniciador de ARN é removido e o intervalo é preenchido pela ADN-polimerase I em procariotas e a ADN-polimerase β em eucariotas.

4. Polimerases de DNA:

Os procariotas possuem três tipos principais de enzimas sintetizadoras de DNA chamadas DNA polimerases III, II e I. Todos eles adicionam nucleotídeos na direção 5 '-> 3' em 3 '-> 5' estiramento da fita mãe. Eles também possuem 3 '-> 5' exo-nuclease atividade. Enquanto a DNA polimerase III está envolvida principalmente na replicação do DNA (adição e polimerização de novas bases), a polimerase I é a principal enzima de reparo. Polimerase II é enzima de reparação menor.

DNA polimerase I também tem 5 -> 3 atividade exonuclease. Em eucariotos são encontrados cinco tipos de DNA polimerases - α, β, γ, δ e ε, mas os três principais são α, δ e e. A polimerase 8 está envolvida na replicação da cadeia principal. A polimerase pode ajudar na síntese de filamentos atrasados ​​junto com outros papéis. A polimerase α é a maior e principal enzima de replicação do DNA. Todas as polimerases de ADN têm uma configuração de segurar a mão com o polegar num dos lados, dedos no outro e o local catalítico côncavo para a palma, para combinar os pares molde e base.

5. Emparelhamento de base:

Os dois segmentos de DNA separados na função bifurcação de replicação como modelos. Os trifosfatos de desoxirribonucleósidos encontram-se em oposição às bases de azoto dos moldes de ADN expostos - deTTP oposto a A, deCTP oposto a G, deATP oposto a T e deGTP oposto a C.

Ataque nucleofílico separa um pirofosfato (PPi) do trifosfato. Ligações fosfodiéster são estabelecidas. A hidrólise do pirofosfato pela enzima pirofosfatase libera energia. Trifosfato desoxirribonucleósido → Monofosfato de desoxirribouncoseosídeo + PPi

A energia é usada no estabelecimento de ligações de hidrogênio entre os nucleotídeos livres e as bases de nitrogênio dos modelos.

6. Formação da Cadeia:

Requer ADN polimerase III (Kornberg, 1956) em procariotas e polimerase δ / e em eucariotas. A DNA polimerase III é uma enzima complexa com sete subunidades (a, β, ƍ, ƴ, €, θ, τ). Na presença de Mg ²⁺, ATP (GTP), TPP e DNA polimerase III, os nucleotídeos adjacentes encontrados ligados às bases de nitrogênio de cada fita de DNA molde estabelecem ligações fosfodiéster e se ligam para formar uma cadeia de DNA replicada.

À medida que a replicação prossegue, novas áreas de DNA duplex são desenroladas e separadas, de modo que a replicação prossegue rapidamente do local de origem para a outra extremidade. O iniciador de RNA �removido e o espa� preenchido com nucle�idos complementares por meio de ADN-polimerase I. Devido � abertura sequencial da cadeia dupla de ADN e sua replica�o para formar duas cadeias, a replica�o de ADN � tamb� chamada duplica�o de fecho de correr.

No entanto, a ADN-polimerase pode polimerizar nucleótidos apenas na direcção 5 '→ 3' na cadeia 3 '-> 5' porque os adiciona ao extremo 3 '. Como os dois filamentos de DNA são executados em direções antiparalelas, os dois modelos fornecem diferentes fins para replicação. A replicação dos dois modelos prossegue em direções opostas. Uma vertente com polaridade У -> 5 ′ forma a sua cadeia complementar de forma contínua, porque a extremidade da terceira está sempre aberta para o alongamento.

É chamado de cadeia principal. A replicação é descontínua no outro gabarito com polaridade 5 ′ → 3, porque somente um segmento curto de filamento de DNA pode ser construído na direção 5 ′ → 3 devido à exposição de um pequeno trecho de gabarito ao mesmo tempo. Pequenos segmentos de DNA replicado são chamados de fragmentos de Okazaki (= segmentos de Okasaki; Reiji Okazaki, 1968). Cada um deles tem 1000-2000 pb em procariontes e 100-200 pb em eucariotos.

Um primer de RNA também é necessário toda vez que um novo fragmento de Okazaki é construído. Depois de substituir o iniciador de RNA com desoxirribonucleótidos e a sua polimerização, os fragmentos de Okazaki são ligados por meio de enzima, DNA ligase (Khorana, 1967). O filamento de DNA formado por fragmentos de Okazaki é chamado de filamento atrasado.

Como um fio cresce continuamente enquanto o outro fio é formado descontinuamente, a replicação do DNA é semi-descontínua. Como a replicação procede bidirecionalmente a partir da origem de replicação ou ori, uma cadeia pai formará uma cadeia líder em um lado e uma cadeia atrasada no outro lado. O inverso ocorre nas cadeias principais do outro lado. Isso ajuda a completar a replicação simultaneamente em todo o replicon.

7. Leitura de prova e reparo de DNA:

Às vezes, uma base errada é introduzida durante a replicação. A frequência é uma em dez mil. DNA polimerase III é capaz de sentir o mesmo. Ele volta, remove a base errada, permite a adição da base adequada e, em seguida, avança. No entanto, mesmo a DNA polimerase III é incapaz de distinguir o uracilo da timina, de modo que é frequentemente incorporado no lugar da timina. Tal desajuste é corrigido por meio de várias enzimas.

Existe um mecanismo de reparo separado para qualquer dano causado ao DNA devido a mutação, exposição UV ou incompatibilidade que escapa do mecanismo de leitura de prova. Um corte ou quebra é causado por uma endonuclease perto da região de reparo. A DNA polimerase I (Komberg, 1969) remove os nucleótidos não coincidentes ou errados, se presentes, e sintetiza uma substituição correcta utilizando a cadeia intacta como modelo. O segmento recém-formado é selado por DNA ligase.