3 Etapas Seqüenciais da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Os seguintes pontos destacam os três principais passos sequenciais da reação em cadeia da polimerase (PCR). Os passos sequenciais são: Desnaturação 2. Recozimento 3. Extensão do DNA.

Etapa sequencial nº 1. Desnaturante:

O primeiro passo é desnaturar o DNA (tanto o DNA Primer quanto o DNA nativo). A separação de duas fitas de DNA é conhecida como desnaturante, enquanto que a junção de dois suportes é chamada de recozimento ou hibridização (Fig. 48.1). A descoberta da desnaturação e recozimento do DNA foi feita artificialmente por Marmor e Lane (1960).

Segundo eles, o DNA de cadeia dupla poderia ser separado em duas cadeias separadas (desnaturante) por aquecimento a uma temperatura elevada (90-95 ° C) e hibridação ou união de duas cadeias de DNA (DNA de cadeia dupla) que é possível por diminuindo a temperatura (50-56 ° C).

Este é o princípio principal no qual a PCR funciona. O segundo princípio é a extensão do primer com a ajuda da enzima DNA polimerase.

O ADN nativo, o iniciador e a enzima DNA polimerase (Tag polimerase) são adicionados num tubo de PCR e a temperatura é aumentada e diminuída na máquina de PCR para desnaturar e hibridar.

Etapa Seqüencial nº 2. Recozimento:

Depois de desnaturar o ADN, o passo seguinte é permitir que o iniciador sintetizável se emparelhe com as cadeias de ADN opostas da sequência alvo desejada. O recozimento (hibridação) pode ocorrer se a temperatura de 95 ° C for reduzida para 50/56 ° C. A temperatura é então baixada na máquina.

Assim que a temperatura é reduzida, as cadeias de DNA nativas se ligam não apenas umas às outras, mas também se ligam aos primers. Essa hibridação específica, ou “recombinação” de nucleotídeos complementares, fornece tanto a base lógica quanto a base prática para grande parte do DNA recombinante (Fig. 48.2).

Passo sequencial # 3. Extensão do DNA (Enzima Taq Polimerase é necessária):

Após os primers terem sido recozidos, eles devem ser estendidos usando o primer oligonucleotídeo como o ponto de iniciação. descreveram que a enzima DNA polimerase é necessária para a síntese do DNA. Portanto, para extensão do primer, precisamos de uma DNA polimerase termo estável, de modo que a enzima não seja destruída em alta temperatura.

A polimerase termoest�el (polimerase Taq) �isolada a partir de Thermus aquaticus. A polimerase Taq tem uma tremenda vantagem na realização da reação de PCR. Tem uma temperatura ótima de atividade em torno de 70 ° C e a enzima fresca não deve ser adicionada a cada tubo de ensaio após o processo de aquecimento e resfriamento.

A DNA polimerase termoestável é agora fabricada por diferentes empresas com diferentes fontes (diferentes de Thermus aquaticus) sob diferentes nomes comerciais (TM). Para a extensão do primer, a DNA polimerase termoestável é adicionada ao tubo e a temperatura é então aumentada para 65-70 ° C.

Ciclos subsequentes de separação de cadeias (desnaturação), hibridização de primers (annealing) e síntese de cadeias (extensão) asseguram amplificação exponencial das sequências alvo usando a sequência amplificada se o ciclo anterior como um novo modelo, existem três ciclos (Fig. 48.2 ).

Primer Making:

Os primers são de seqüência curta (geralmente RNA) é usado para fazer dois nucleotídeos, referidos como primer, com um para cada extremidade do fragmento de DNA e fornece uma extremidade 3-OH livre na qual uma DNA polimerase inicia a síntese de uma cadeia desoxirribonucleotídeo.

Uma sequência é feita na direção do sentido, enquanto a outra é feita na direção anti-senso. (Fig. 48.2). O primer é usado para iniciar a síntese de cadeias de DNA complementares e projetado de tal forma que o DNA entre os primers é o fragmento de interesse a ser amplificado.

Se o RNA mensageiro (mRNA) for amplificado, ele deve ser convertido em DNA complementar (cDNA) por uma DNA polimerase dependente de RNA, transcriptase reversa. O complexo de cDNA é então transformado em DNA de cadeia dupla, tornando-se modelo para uma reação de PCR subsequente.

Isto é frequentemente conhecido como reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa (RT PCR). Os primers podem ser gerados artificialmente ou podem ser comprados das firmas.

Após a conclusão da reação, os produtos amplificados (DNA) podem ser visualizados por eletroforese em gel. A propriedade física importante da molécula de DNA é que cada nucleotídeo individual possui uma carga negativa resultante do grupo fosfato.

Assim, fragmentos de diferentes tamanhos expostos a um campo elétrico tendem a migrar para o eletrodo positivo a uma taxa diferente, dependendo do tamanho, com pequenos fragmentos migrando mais rápido que o maior. Este processo de separação de carga elétrica é chamado de eletroforese.

As amostras de DNA, depois de serem digeridas em fragmentos de tamanhos diferentes por uma enzima de restrição (endonuclease), são adicionadas ao meio de suporte tal como gel grosso ou acrilamida. Os poros do gel dependem de sua porcentagem e podem ser comparados a uma peneira (molecular). Assim, a velocidade de migrao dos fragmentos de ADN atrav de gel depende tanto do tamanho do fragmento de ADN como da voltagem aplicada.

O procedimento para separar e deduzir o fragmento de DNA específico é o Southern blotting. A importância dessa técnica é que o fragmento de fita simples pode ser transferido por ação capilar para um meio de suporte sólido (Nylon ou membrana de celulose) e permanentemente fixado por aquecimento (Fig. 48.3).

Após a eletroforese, o padrão de DNA pode ser visualizado sob luz UV após o tratamento com corante de brometo de etídio; o brometo de etídio é um corante fluorescente. A electroforese em gel de agrose distinguiu fragmentos de 100 pares de bases a 60000 pares de bases (60 kb) ao passo que os géis de poliacrilamida separam eficazmente fragmentos de 1000 pares de bases (1 kb).

Eletroforese em gel de pulso (PFGE) tornou possível a separação de fragmentos de DNA até 2kb. Nesse procedimento, o campo elétrico é alterado em direções diferentes, forçando as moléculas de DNA a se reorientarem entre cada pulso, ou corrente elétrica. Esta é a melhor técnica para identificar um gene conhecido.

As endonucleases podem reconhecer 3, 4, 5, 6 ou 8 pares de bases e estão disponíveis no mercado.

Tampões de PCR / sais.

Para Taq DNA polimerase, o buffer é feito como abaixo:

KCI 50 mM

Tris-HCI 10 mM a temperatura ambiente

O dimetilsulfóxido (DMSO) e o glicol são utilizados como co-solvente em tampões de PCR quando o alvo tem uma temperatura de desnaturação muito elevada.

Trifosfato de desoxinucleotídeo (dNTPs) são cofatores de íons.

Agora, as empresas de biotecnologia estão fornecendo soluções preparadas.

O princípio básico é descrito da seguinte forma:

Existem quatro dNTPs, nomeadamente dATP (adenina trifosfato), dCTP (citosina), dGTP (gunina), dUTP (uracilo) que são utilizados de acordo com as regras do par de bases para prolongar o iniciador e, finalmente, para copiar a sequência alvo.

O dNTP liga-se ao Mg ²⁺ . A quantidade de dNTPs presentes em uma reação determinará a quantidade de Mg ²⁺ livre disponível para a atividade enzimática ótima. As soluções de estoque de dNTP devem ser neutralizadas com Tris base para pH 7, 0 e sua concentração deve ser determinada espectrofotometricamente.

Análogos de Substrato e Substrato:

Taq polimerase funciona (dNTP) de forma muito eficaz. No entanto, existem alguns substratos modificados disponíveis no lugar do substrato de DNA polimerase Tag. Eles são o NTP do tipo dogoxigenina, biotina-11-dUTP, C7deaza-dGTP e dNTPS marcados fluorescentemente.

Os seguintes tipos de PCR estão em uso geral:

(1) PCR aninhada;

(2) RT-PCR;

(3) PCR de ancoragem;

(4) PCR assimétrico;

(5) PCR Inverso;

(6) DOP-PCR.