Teste de oxidase em bactérias para descobrir sua capacidade de hidrolisar gelatina, produzindo gelatinase

Teste de oxidase em bactérias para descobrir sua capacidade de hidrolisar gelatina, produzindo gelatinase!

Princípio:

Algumas bactérias têm a capacidade de hidrolisar a gelatina, pois podem produzir a enzima proteolítica 'gelatinase'.

Enquanto a gelatina é precipitada pelo cloreto mercúrico produzindo translucidez, seus produtos finais hidrolisados não são precipitados pelo cloreto de mercúrio, para o qual eles não produzem tal translucidez, mas produzem transparência.

No teste de gelatinização, a bactéria de teste é cultivada em placas de ágar contendo gelatina. Depois que as colônias das bactérias são visíveis, as placas são inundadas com uma solução de cloreto de mercúrio. Se as bactérias tiverem a capacidade de hidrolisar a gelatina, as suas colónias hidrolisam a gelatina no meio nas áreas que as rodeiam, enquanto as restantes áreas das placas retêm a gelatina não hidrolisada.

Como resultado, quando inundadas com uma solução de cloreto de mercúrio, zonas claras e transparentes são formadas ao redor das colônias, já que os produtos hidrolisados formados ao redor deles não formam precipitados com o cloreto de mercúrio. Por outro lado, as restantes áreas das placas tornam-se translúcidas, uma vez que a gelatina não hidrolisada nestas áreas forma precipitados com cloreto mercúrico.

Materiais requisitados:

Placas de Petri, frasco cônico, tampões de algodão, alça de inoculação, autoclave, bico de bunsen, câmara de fluxo laminar, jarra de descarte, incubadora, ágar de gelatina Fraizer, solução de cloreto de mercúrio, colônias isoladas ou culturas puras de bactérias.

Procedimento:

1. Duas placas de petri são limpas, cobertas com papel craft e amarradas com fio ou elástico (Figura 7.20). Este passo, bem como a esterilização das placas de petri no passo 6, são omitidos, se as placas de Petri esterilizadas no forno forem utilizadas directamente

2. Os ingredientes do meio Gelatin Agar da Fraizer (contendo a gelatina como componente principal) ou o seu pó pronto para 100 ml do meio são pesados e dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml, agitando e agitando. .

3. O seu pH é determinado utilizando um papel de pH ou um medidor de pH e ajustado para 7, 2 utilizando HCl 0, 1 N se for mais ou utilizando NaOH 0, 1 N se for inferior.

4. O balão é aquecido para dissolver o ágar no meio completamente.

5. O frasco é de algodão, coberto com papel ofício e amarrado com fio ou elástico.

6. As duas placas de petri e o frasco cônico contendo o meio de gelatina Agar da Fraizer são esterilizados a 121 ° C (15 psi de pressão) por 15 minutos em autoclave.

7. Após a esterilização, eles são removidos da autoclave e deixados esfriar por algum tempo sem permitir que o meio solidifique. O resfriamento do meio evita a condensação e o acúmulo de gotículas de água dentro das placas. Se o meio já tiver sido preparado e solidificado durante o armazenamento, ele deve ser liquefeito aquecendo cuidadosamente até que derreta completamente.

8. Para preparar placas de ágar gelatinoso, antes do meio de gelatina Frazier esterilizado esfriar e solidificar, em estado de fusão quente, ele é vertido assepticamente, preferencialmente dentro de uma câmara de fluxo laminar, para as duas placas de Petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada). que o meio derretido cobre completamente o fundo das placas de petri.

Em seguida, as placas são cobertas com as tampas e deixadas esfriar, de modo a solidificar o meio dentro delas. O vapor de água que pode condensar na superfície interna das placas e tampas é evaporado mantendo as placas e as tampas invertidas em uma incubadora a 37 ° C por aproximadamente 1 hora.

9. Cada placa é marcada no lado inferior em quatro trimestres.

10. A “inoculação pontual” das bactérias de teste é feita assepticamente, preferencialmente dentro de uma câmara de fluxo laminar, no centro de cada quarto, fazendo um ponto (ou pequeno esfregaço) das bactérias com a ajuda de um laço esterilizado por chama. O laço é esterilizado após cada inoculação.

11. As placas inoculadas são incubadas em posição invertida, de cima para baixo, a 37 ° C por 24 a 48 horas em uma incubadora até que as colônias das bactérias sejam visíveis.

12. As placas são inundadas com solução de cloreto de mercúrio (HgCl ₂ ).