No teste de dole para descobrir a capacidade de uma bactéria para hidrolisar o triptofano de aminoácidos (com figura)

Em teste Teste para descobrir a capacidade de uma bactéria para hidrolisar o aminoácido triptofano!

Princípio:

Algumas bactérias têm a capacidade de hidrolisar o aminoácido triptofano a indole, pois podem produzir a enzima triptofanase.

O triptofano é hidrolisado com a produção de ácido indol, pirúvico e amônia. O indole é detectado pelo reagente de cor, o paradimilaminobenzaldeído (p-DMAB, ou seja, o reagente de Kovac), que produz um anel rosa. O indol reage com o p-DMAB para produzir o composto 'composto vermelho-violeta quinoidal (corante de rosindole)', que é de cor rosa. O anel é produzido na superfície, como o reagente é preparado em álcool amílico.

No teste de indole, a bactéria de teste é cultivada num meio de caldo contendo triptofano. Se a bactéria tem a capacidade de hidrolisar o triptofano em indol, um anel rosa é formado na superfície da cultura de caldo após a adição de p-DMAB.

Materiais requisitados:

Tubos de ensaio, frasco cônico, tampões de algodão, alça de inoculação, autoclave, bico de bunsen, câmara de fluxo laminar, jarra, incubadora, caldo triptona, reagente de Kovac (paradimietilaminobenzaldeído), colônias isoladas ou culturas puras de bactérias.

Procedimento:

1. Os ingredientes do meio de caldo triptona ou do seu pó preparado necessário para 100 ml do caldo são pesados e dissolvidos em 100 ml de água destilada num balão cónico de 250 ml, agitando e agitando. O triptona atua como uma fonte de triptofano. Portanto, a adição de triptofano ao caldo é opcional (Figura 7.3).

2. Seu pH é determinado usando um papel de pH ou medidor de pH e ajustado para 7.5 usando HC1 0.1N se é mais ou usando NaOH 0.1N se for menor. O frasco é aquecido, se necessário, para dissolver completamente os ingredientes.

3. O caldo é distribuído em cinco tubos de ensaio (aproximadamente 5 ml cada), tapado com algodão, coberto com papel craft e amarrado com fio ou elástico.

4. Os tubos de caldo são esterilizados a 121 ° C (15 psi de pressão) por 15 minutos em autoclave.

5. Os tubos de caldo são deixados a arrefecer até à temperatura ambiente.

6. A bactéria teste é inoculada assepticamente, preferencialmente em uma câmara de fluxo laminar, no caldo com a ajuda de uma alça de inoculação esterilizada sobre a chama de bunsen. O laço é esterilizado após cada inoculação.

7. Os tubos de caldo inoculados são incubados a 37 ° C durante 48 horas numa incubadora.

8. O reagente de cor, para-dimetilaminobenzaldeído (p-DMAB) (ie reagente de Kovac) é vertido nos tubos de caldo (0, 5 ml cada) e observado após 1 minuto.

Alternativamente:

7. As tiras de papel embebidas em ácido oxálico são colocadas na boca dos tubos de caldo inoculados, de modo que cerca de metade das tiras de papel permanecem no interior dos tubos sem tocar no caldo e a outra metade permanece no exterior. Para isso, o papel de filtro é cortado em tiras de aproximadamente 35 mm de comprimento e 5 mm de largura. As tiras são embebidas em solução aquosa saturada quente de ácido oxálico e secas antes da utilização.

8. Os tubos de caldo inoculados são incubados a 37 ° C durante 48 horas numa incubadora.